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大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库构建及部分差异基因分析

左红梅

  近年来,随着抗生素的滥用,病原微生物的耐药性问题不断加剧。因此,发现和筛选具有新作用机理的抗菌药物已成为当前医药研究领域的迫切需要。抗菌肽(antibacterial peptide,AMP)由于具有独特的抗菌机理,仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,且不易引起病原菌产生耐药性,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物,因而成为目前抗菌药物开发研究的热点。 家蝇(Musca domestica)从幼虫到成虫均生活在杂菌横生的环境里,其体内外通常携带有害因子数量多达数万亿,能够机械性的传播人、畜等多种病原体,而自身并不感染。家蝇与其他昆虫和动物体相比对病原微生物有着更为强大的免疫力,这种强大的免疫力可能是其体内外抗菌活性物质作用的结果,其中最主要的成分为抗菌肽,这些物质是家蝇免受多种病原微生物感染的重要保证。因此,家蝇是开发抗菌肽等新兴抗菌药物的重要资源。然而,从家蝇体内提取天然抗菌肽具有提取成本较高、产品质量不稳定等弊端。通过基因工程技术构建高效表达抗菌肽的工程菌,是规模化生产抗菌肽的理想途径之一,而抗菌肽基因的获取,.是该项技术的基础。因此,家蝇体内抗菌肽基因的筛选为临床抗菌药物的开发研究提供了新的途径。 本研究以家蝇幼虫为研究对象,以高致病性大肠杆菌作为抗菌肽表达的诱导源,通过完全随机设计,将100只家蝇幼虫随机平均分成两组,一组采用腹部针刺感染法进行大肠杆菌诱导处理,为诱导组,另一组不进行诱导处理,为正常组。在相同的条件下饲养24h后,分别提取两组幼虫的总RNA,并采用磁珠法进一步分离、纯化mRNA,并分别反转录制得诱导组cDNA、正常组cDNA。以诱导组cDNA为Tester,正常组cDNA为Driver,采用抑制消减杂交(SSH)技术构建家蝇幼虫正向消减cDNA文库;以正常组cDNA为Tester,诱导组cDNA为Driver,采用相同技术构建反向消减cDNA文库。通过PCR和斑点杂交两轮筛选后,从文库中挑取阳性克隆进行测序并在线BLAST比较分析。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得差异基因的全长,T-A克隆后测序分析。 本研究的主要结果如下: 对正向消减文库的527个单克隆进行菌液PCR筛选,结果表明:鉴定出492个阳性单克隆片段,文库阳性率为93.4%;插入的片段大小主要在250-1000bp之间,片段平均大小在600bp左右,初步表明消减文库构建成功,说明抑制性消减杂交技术的假阳性低,适用于低丰度差异基因的筛选。经斑点杂交筛选后,确定132个阳性克隆并进行序列测定,分析结果表明:消减文库中差异表达基因包括细胞色素氧化酶、a-胰蛋白酶、金属硫蛋白、表皮蛋白、热休克蛋白、溶菌酶基因、天蚕素基因、防御素基因、攻击素基因、泛素等,同时还获得了一些未知功能的EST序列,说明还有许多未知基因有待于研究鉴定。通过RACE技术对筛选出的5个抗菌肽基因,即:1个天蚕素基因,3个防御素基因,1个攻击素基因,以及一个未知基因进行序列延伸,序列接拼后进行核苷酸序列及氨基酸序列的分析,结果表明:所克隆的5个抗菌肽基因与对应的家蝇抗菌肽基因都有很高的相似性,而未知基因在数据库中尚找不到相似性高的同源序列。……   
[关键词]:家蝇幼虫;抗菌肽;抑制消减杂交;cDNA末端快速扩增
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2011年