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和厚朴酚与青蒿素协同抗鼻咽癌细胞的作用及其机制研究

王春玲

  目的: 研究和厚朴酚联合青蒿素作用CNE-2、SPC-A-1、MGC-803细胞是否具有协同抗肿瘤效应;进一步探索两药联合作用CNE-2细胞产生协同效应的机制,为两者临床联合化疗的应用提供实验基础。 方法: 1、将处于对数生长期的CNE-2、SPC-A-1、MGC-803. LO-2细胞分别用不同浓度的和厚朴酚或青蒿素处理,分析不同浓度供试物的抑制率,为进一步的联合用药选取最适药物浓度。将处于对数生长期的CNE-2、SPC-A-1、MGC-803细胞分别以和厚朴酚为固定最适浓度,选取一定浓度范围的青蒿素处理细胞48小时,后用MTT法检测不同配比浓度的供试物的抑制率;通过分析所获得的实验数据,明确和厚朴酚与青蒿素之间是否具有协同抗肿瘤的作用。 2、收集处于对数生长期的CNE-2细胞,用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化后,以和厚朴酚+青蒿素,单药和厚朴酚,单药青蒿素处理细胞24h后,收集对照组及供试物处理后的细胞,应用流式细胞仪检测各供试物对细胞周期分布的影响。 3、收集处于对数生长期的CNE-2细胞,以和厚朴酚+青蒿素,单药和厚朴酚,单药青蒿素处理细胞48h后用DAPI染色法在荧光显微镜下观察各供试物对CNE-2细胞形态学的影响。采用流式细胞仪检测药物处理细胞48h后对细胞凋亡的影响。 4、用胸腺嘧啶核苷双阻断法使细胞同步化后,以和厚朴酚+青蒿素,单药和厚朴酚,单药青蒿素处理细胞24h或48h,按照RT-PCR的流程制取RNA标本,分析各供试物对cyclinD1 mRNA、cyclinE1 mRNA及P27mRNA等表达的影响。 5、分别于和厚朴酚、青蒿素单独及二者联合作用0h、6h、12h后收集细胞用Western Blot检测其对胞浆中ctyochrome c表达的影响。 6、分别于和厚朴酚、青蒿素单独及二者联合作用0h、24h、48h后收集细胞用Western Blot检测其对bcl-2、bax表达的影响。 7、分别于和厚朴酚、青蒿素单独及二者联合作用48h后收集细胞用Western Blot检测其对caspase-3蛋白表达的影响。 8、分别于和厚朴酚、青蒿素单独及二者联合作用5h后收集细胞用流式细胞术检测其对线粒体膜电位的影响 9、分别于和厚朴酚、青蒿素单独及二者联合作用0h、24h、48h后收集细胞用流式细胞术检测其对死亡受体的影响。 10和厚朴酚、青蒿素及二者联合作用CNE-2细胞48h后用RT-PCR及Western Blot两种方法检测对COX-2基因及蛋白表达的影响。 11、统计学分析:采用SPSS13.0版统计软件的进行统计学分析,统计学处理采用t检验、单因素方差分析,以p<0.05为差异有显著性意义,协同效应按金氏公式求得。 结果: 1、①和厚朴酚、青蒿素对CNE-2、SPC-A-1、MGC-803、LO2细胞株的生长抑制作用 和厚朴酚对CNE-2、SPC-A-1、MGC-803、L-O2细胞的IC50分别为8.58μg/ml、8.20μg/ml、3.95μg/ml、8.04μg/ml。青蒿素对CNE-2、SPC-A-1、MGC-803、LO2细胞的ICso分别为62.24μg/ml、53.52μg/ml、64.85μg/ml、93.92μg/ml。 ②和厚朴酚与青蒿素联合应用对CNE-2、SPC-A-1、MGC-803细胞株的生长抑制作用 选取和厚朴酚的终浓度为:7.5、5.0μg/ml (CNE-2、SPC-A-1) 3.5、2.0μg/ml (MGC-803);选取青蒿素的终浓度为:7.5、10.0、12.5、15.0、20.0、30.0μg/ml.每个浓度的和厚朴酚分别与不同浓度的青蒿素联合应用,作用于上述细胞48h。结果显示,和厚朴酚与青蒿素联合用药组的抑制率明显高于单独用药组。和厚朴酚与青蒿素联合作用CNE-2、SPC-A-1细胞Q值均>1.15,表明和厚朴酚与青蒿素联合应用具有协同抗CNE-2、SPC-A-1细胞作用,联合应用于MGC-803细胞时具有协同或相加作用。 2、和厚朴酚联合青蒿素对CNE-2细胞周期的影响 结果表明,同步化结束后释放Oh时取样,G1、S、G2期细胞比例分别为(72.64±5.005)%、(24.60±±4.35)%、(0.00%)。空白对照组G1、S、G2期细胞比例分别为(66.59±3.34)%、(32.80±±3.28)%、(0.00%);厚朴酚、青蒿素及二者联合作用CNE-2细胞24h后,和厚朴酚(7.5μg/ml) G1、S、G2期细胞比例分别为(67.86±±1.59)%、(30.39±±1.37)%、(0.00%),青蒿素(7.5μg/ml) G1、S、G2期细胞比例分别为(66.77±2.25)%、(33.23±2.26)%、(0.00%),联合用药组G1、S、G2期细胞比例分别为(90.78±±1.49)%、(2.38±0.24)%、(6.70±±9.46)%,与和厚朴酚或青蒿素单独用药组比,G1期细胞比例增高,S期细胞比例下降(P<0.05)。提示和厚朴酚与青蒿素联合用药可以协同诱导细胞停滞在G1期。 3、和厚朴酚联合青蒿素对CNE-2细胞凋亡的影响 ①DAPI染色后荧光显微镜下可见阴性组边缘清晰,染色均匀。和厚朴酚处理组发出较正常组强的荧光,胞质有浓缩、核染色体凝聚现象,青蒿素处理组可见细胞核完整,未见明显的细胞凋亡,但是,与和厚朴酚联合应用之后,能够显著增强和厚朴酚诱导CNE-2细胞凋亡的能力,镜下可见凋亡细胞数量显著增加,大部分细胞缩小发出强蓝色荧光,胞质浓缩,核染色体高度凝聚、边缘化,细胞核碎裂呈碎片状,出现典型的新月形的凋亡小体。 ②AnnexinV/PI结果显示,7.5μml和厚朴酚分别与2.5、5.0、7.5μg/ml的青蒿素联合应用后,CNE-2细胞凋亡率增加,显著高于等浓度的和厚朴酚或青蒿素组(P<0.05),提示和厚朴酚与青蒿素联合应用时可能以协同模式诱导CNE-2细胞产生凋亡。 4、和厚朴酚联合青蒿素应用对cyclinD1 mRNA、cyclinE1 mRNA及P27mRNA表达的影响 RT-PCR检测结果发现和厚朴酚或/和青蒿素作用CNE-2细胞24h均能抑伟cyclinD1 mRNA、cyclinE1 mRNA表达,上调P27mRNA (P<0.05)。与正常对照组、和厚朴酚组、青蒿素组比较,和厚朴酚与青蒿素联合用药组,更能显著抑制cyclinD1mRNA, cyclinE1mRNA表达(P<0.05)。与和厚朴酚组、青蒿素组比较,和厚朴酚与青蒿素联合用药处理CNE-2细胞24h后P27mRNA表达增加(P<0.05),与对照组比较,无显著性差异(P>0.05)。 5、和厚朴酚联合青蒿素作用对cytochrome c表达的影响 Western blot结果表明:和厚朴酚(7.5μg/ml)、青蒿素(7.5μg/ml)及二者联合作用CNE-2细胞6h、12h,由线粒体释放到胞浆中的cytochrome c均增多。与正常对照组、和厚朴酚单药组、青蒿素单药组相比,联合用药组超过药物单独作用时的释放量(P<0.05),表明和厚朴酚(7.5μg/ml)+青蒿素(7.5μg/ml)联合作用能够协同增加细胞线粒体内cytochrome c的释放。 6、和厚朴酚联合青蒿素作用对Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 和厚朴酚(7.5μg/ml)与青蒿素(7.5μg/ml)联合作用CNE-2细胞24h、48h,Bax、Bcl-2的表达显著增强,超过和厚朴酚(7.5μg/ml)、青蒿素(7.5μg/ml)单独作用时的表达量,表明和厚朴酚(7.5μg/ml)与青蒿素(7.5μg/ml)联合作用能够显著增加Bax、Bcl-2的表达,但是,Bax的表达量比Bcl-2增加的趋势强。因此和厚朴酚与青蒿素联合应用通过上调Bax的表达诱导CNE-2细胞凋亡。 7、和厚朴酚与青蒿素联合作用对caspase-3蛋白表达的影响 Western Blot结果显示和厚朴酚、青蒿素及二者联合作用CNE-2细胞48h后Procaspase-3逐渐发生降解,剪切得到caspase-3,且和厚朴酚与青蒿素联合用药组的caspase-3,表达量稍强于和厚朴酚、强于青蒿素组。 8、和厚朴酚联合青蒿素作用对线粒体膜电位的影响 流式细胞仪检测结果表明和厚朴酚、青蒿素及二者联合作用CNE-2细胞5h后,线粒体膜电位下降,分别是(1.51±0.65)%、(4.68±0.79)%、(4.43±1.12)%、(21.56±1.28)%,与和厚朴酚组、青蒿素组相比,联合用药组细胞线粒体膜电位表现为去极化(P<0.05)。 9、和厚朴酚联合青蒿素作用对Fas/FasL蛋白表达的影响 结果表明,药物作用CNE-2细胞24h、48h, FasL蛋白的表达量没有增多,Fas蛋白表达量基本不变。说明和厚朴酚与青蒿素联合诱导CNE-2细胞凋亡不依赖Fas/FasL的相互作用。 10、和厚朴酚联合青蒿素作用对COX-2表达的影响 RT-PCR、Western Blot两种检测方法结果表明0、和厚朴酚(7.5μg/ml)、青蒿素(7.5μg/ml)及和厚朴酚(7.5μg/ml)+青蒿素(7.5μg/ml)作用CNE-2细胞48h,联合用药组COX-2基因或蛋白表达均减少,有显著性差异(p<0.05)。 结论: 1、和厚朴酚可抑制人鼻咽癌CNE-2、肺腺癌SPC-A-1细胞、胃癌MGC-803细胞及正常肝细胞株LO2生长,且呈浓度相关性。 2、青蒿素可对人鼻咽癌CNE-2、肺腺癌SPC-A-1细胞、人胃癌MGC-803细胞没有明显的生长抑制作用,对正常肝细胞株L02的毒性小。 3、和厚朴酚与青蒿素联合应用对人鼻咽癌CNE-2、肺腺癌SPC-A-1细胞具有协同作用,对人胃癌MGC-803细胞呈现协同或相加作用。 4、和厚朴酚与青蒿素联合应用可诱导人鼻咽癌CNE-2细胞凋亡和细胞周期阻滞。 5、和厚朴酚与青蒿素联合应用诱导CNE-2细胞周期阻滞过程中涉及cyclinD1 mRNA、cyclinE1 mRNA等基因表达的变化,细胞凋亡过程中涉及Bcl-2、Bax、cytochromec caspase-3、COX-2的变化。凋亡过程并不依赖Fas/FasL的相互作用而是通过线粒体途径诱导CNE-2细胞凋亡。 6、我们的实验研究为鼻咽癌的临床化疗方案的选择提供了新的思路和实验基础。……   
[关键词]:和厚朴酚;青蒿素;细胞凋亡;细胞周期;协同作用
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:广州中医药大学2011年
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