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当归四逆汤成分组合预处理对MIRI大鼠MMVEC eNOS/NO信号通路的影响研究

钱国强

  目的:建立SD大鼠心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)模型,观察当归四逆汤中四种单体成分甘草酸、阿魏酸、芍药苷、肉桂酸及其组合对MIRI大鼠心肌微血管内皮细胞(myocardial microvascular endothelial cell, MMVEC) eNOS/NO信号通路的影响,探讨当归四逆汤治疗MIRI的微血管机制,为防治MIRI提供新的思路。 方法:实验分两步进行:第一步,以正交设计法筛选当归四逆汤中甘草酸、阿魏酸、芍药苷、肉桂酸四种单体抗MIRI大鼠MMVEC损伤的最佳组合(best combination of glycyrrhizic acid, ferulic acid, paeoniflorin, cinnamic acid, GFPC)。药物预处理(pharmacological preconditioning, PPC)采用四种单体及其组合于造模前预防性灌服四天,每天一次,最后一次于造模前30min给药。正交设计采用四因素(四种单体)四水平(每个单体四个剂量水平),将112只SD大鼠按正交设计分为16组,每组7只,用结扎冠脉左前降支(Left anterior descending coronary artery, LAD)的方法造成SD大鼠MIRI模型,结扎30min,再灌注2h,观察心电图改变及心肌HE染色确定模型可靠性和稳定性;造模结束后,腹主动脉取血,药效学观察指标为血清中NO、ET、SOD、MDA含量,应用硝酸还原法检测血清NO含量;放射免疫法检测血清ET水平;硫代巴比妥酸(TBA)法检测MDA含量;氮蓝四唑(NBT)显色法检测SOD。 第二步,应用筛选出的最佳成分组合GFPC开展对MIRI大鼠MMVEC的eNOS/NO信号通路调节机制研究。将32只SD大鼠分为shame组(假手术组,开胸只穿线,不结扎),I/R组(MIRI模型),PPC组(MIRI+单体组合灌胃),PPC+L组(MIRI+单体组合灌胃+eNOS选择性阻断剂Nω-硝基L-精氨酸甲酯,再灌注前15min,30mg/kg股静脉给药),每组8只。造模结束后,取心尖部固定,切片,电镜观察MMVEC凋亡及形态学改变;TUNEL法检测MMVEC凋亡率,腹主动脉取血,应用硝酸还原法检测血清NO含量,血液流变仪检测血液流变学指标;取左心室,切取200mg提取MMVEC和鉴定,采用real-time RT-PCR检测大鼠MMVEC eNOS和iNOSmRNA的表达;切取左心室200mg提取MMVEC, western blot的方法检测eNOS和iNOS蛋白的表达。 所有数据均以均数±标准差表示,应用SPSS15.0对实验数据进行统计分析,正交设计用方差分析,组间数据比较用单因素方差分析,计数资料的分析用χ2检验,P<0.05有统计学意义。 结果: 1.MIRI模型的验证 心电图示,造模后SD大鼠心电图ST段显著抬高,恢复灌注后ST段显著下降,模型可靠性及可重复性高,心肌HE染色见shame组心肌纹理正常,横纹清晰,而I/R组可见明显的心肌细胞横纹不清,肌细胞空泡变性,肌丝溶解断裂,局部有炎细胞浸润,并可见间质水肿的存在。2.抗MIRI MMVEC损伤的最佳成分组合筛选 再灌注120min后,可有效升高对血清中NO含量的依次为阿魏酸>甘草酸>芍药苷>肉桂酸,即阿魏酸400mg/kg,甘草酸50 mg/kg,芍药苷0 mg/kg,肉桂酸0 mg/kg;可有效降低血清ET含量的依次为阿魏酸>肉桂酸>芍药苷>甘草酸,即阿魏酸300mg/kg,肉桂酸400 mg/kg,芍药苷0 mg/kg,甘草酸0 mg/kg,;可有效升高血清中SOD含量的依次为芍药苷>肉桂酸>阿魏酸>甘草酸,即芍药苷100 mg/kg,肉桂酸200 mg/kg,可魏酸Omg/kg,甘草酸0 mg/kg;可有效降低血清中MDA含量的依次为阿魏酸>芍药苷>肉桂酸>甘草酸,即阿魏酸200mg/kg,芍药苷50 mg/kg,肉桂酸0 mg/kg,甘草酸0 mg/kg o综合分析可以有效升高血清NO,降低血清ET,保护内皮功能;同时可以升高SOD减轻氧化应激损伤,降低脂质过氧化物MDA的产生,抗MIRI MMVEC损伤的最佳成分组合(Glycyrrhizic acid, Ferulic acid, Paeoniflorin, Cinnamic acid, GFPC)为甘草酸50mg/kg,阿魏酸400 mg/kg,芍药苷100 mg/kg,肉桂酸400 mg/kg o 3.GFPC对MIRI大鼠MMVEC的eNOS/NO信号通路的影响 (1)与shame组比较,I/R组大鼠血清中NO含量明显降低(P<0.05);与I/R组比较,PPC组血清中NO含量明显升高(P<0.05);与PPC组比较,PPC+L组血清中NO含量明显降低(P<0.05); (2)与shame组比较,I/R组MMVEC eNOS的mRNA表达及eNOS蛋白磷酸化下降明显(P<0.05);与I/R组比较,PPC组MMVEC eNOS mRNA表达及eNOS蛋白磷酸化明显增加(P<0.05);与PPC组比较,PPC+L组MMVEC eNOS的mRNA表达未见明显改变(P>0.05),但eNOS蛋白磷酸化明显减少(P<0.05); (3)与shame组比较,I/R组MMVEC iNOS mRNA和iNOS蛋白的表达明显升高(P<0.05),与I/R比较,PPC组MMVEC iNOS mRNA和iNOS蛋白表达明显降低(P<0.05);PPC组与PPC+L组MMVEC iNOS mRNA和iNOS蛋白表达无明显差异(P>0.05)。 4. GFPC对MIRI大鼠MMVEC RA的影响 与shame组比较,I/R组心律失常发生率显著升高(P<0.05);与I/R组比较,PPC组的发生率显著下降(P<0.05),PPC组与PPC+L组心律失常发生率无明显差异(P>0.05)。 5. GFPC对MIRI大鼠血液流变学的影响 与shame组比较,I/R组红细胞压积显著升高(P<0.05),与I/R组比较,PPC组红细胞压积显著降低(P<0.05);PPC组和PPC+L组红细胞压积无明显差异(P>0.05)。与shame组比较,I/R组纤维蛋白原水平明显升高(P<0.05),与I/R组比较,PPC组及PPC+L组纤维蛋白原水平明显下降(P<0.05),PPC组与PPC+L组纤维蛋白原水平未见明显差异(P>0.05)。 6. GFPC对MIRI大鼠MMVEC形态学的影响 电镜观察shame组MMVEC线粒体膜规整,嵴粒存在,内皱紧密,无空泡,核膜规整,染色质均匀,无浓集现象,核仁存在;I/R组线粒体肿胀,膜不规整,内皱疏松有空泡,嵴粒消失,核膜不规整,染色质浓集,边集,核仁消失,甚至出现凋亡小体;PPC组与I/R组MMVEC损伤较轻;与PPC组比较,PPC+L组MMVEC损伤加重。 7. GFPC对MIRI大鼠MMVEC凋亡的影响 与shame组比较,I/R组MMVEC凋亡率明显升高(P<0.05);与I/R组比较,PPC组MMVEC凋亡率明显下降(P<0.05);与PPC组比较,PPC+L组MMVEC凋亡率有所升高(P<0.05)。 结论: 1.在当归四逆汤四种有效成份中,可提高NO含量、降低ET含量,对抗脂质过氧化,抗MIRI保护MMVEC的GFPC为甘草酸50mg/kg,可魏酸400mg/kg,芍药苷100mg/kg,肉桂酸400 mg/kg。 2.用GFPC药物预处理MIRI大鼠,可升高血清中NO,降低再灌注心律失常的发生率,改善血液流变学,降低MMVEC凋亡率,对抗MIRI引起的MMVEC凋亡。其机制是通过eNOS蛋白磷酸化,激活eNOS/NO信号通路,并上调eNOS mRNA的表达,下调iNOS mRNA和iNOS蛋白的表达,调节MIRI模型中MMVEC功能。 3. GFPC药物预处理对MMVEC的保护机制是:通过增强保护性eNOS基因表达和eNOS蛋白磷酸化,抑制损伤性iNos基因表达和iNOS蛋白合成来实现的。……   
[关键词]:MIRI;MMVEC;甘草酸;阿魏酸;芍药苷;肉桂酸;eNOS;NO
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:暨南大学2011年