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基质金属蛋白酶-12在风湿性心脏病二尖瓣组织中的表达研究

余睿

  基质金属蛋白酶-12(MMP-12)也被称为人巨噬细胞弹性蛋白酶(HME),属含锌的内肽酶家族,参与多种生理过程如血管重塑、纤维蛋白溶酶原代谢和气道炎症及重塑等。在病理状态下,MMP-12引起的细胞外基质的重塑与多种疾病有关:其中包括腹主动脉瘤、动脉粥样硬化、肺气肿、肿瘤、类风湿性关节炎和肝及肺纤维化等。在此基础上本论文工作将对MMP-12在风湿性心脏病二尖瓣组织中的表达情况进行研究。 本论文工作主要由两大实验部分组成。①采用PCR方法从人体肝组织cDNA文库获得编码人体MMP-12(45kDa)的基因片段(1.1kb, GenBank Accession No.:AAA58658.1);此片段经BamHⅠ及XhoⅠ双酶切后连接到同样经BamHⅠ及XhoⅠ双酶切的不带任何标签的pET-17xb载体上,阳性克隆转染E. coli BL21(DE3);经IPTG诱导,蛋白酶以包涵体的形式表达,经过盐酸胍变性、溶解后的蛋白溶液经复性及超滤浓缩后,获得电泳纯的MMP-12活性片段;以EDANS/DabcylPlus为底物,测定蛋白酶裂解底物在Ex/Em= 355/460 nm产生的荧光,并通过酶切实验和明胶酶谱法检测,证实了得到的目的蛋白具有活性。②选取成人风湿性心脏病(RHD)患者行二尖瓣置换术后的二尖瓣实验组,选取非风湿性心脏病患者换瓣术后二尖瓣作为对照组,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western Blot、免疫组织化学染色及荧光酶学方法,检测MMP-12在二尖瓣组织中的表达情况;同时采用荧光酶学方法检测风湿性心脏病患者血清及正常人血清中MMP-12的活性。 本论文的创新性体现在:1)成功构建了MMP-12在大肠杆菌中的表达载体(pET-17xb-MMP12),获得了MMP-12酶活性部位包涵体的变复性方法;2)建立了检测MMP-12酶活性的荧光酶学方法,优化了酶的反应条件;3)在基因、蛋白质和组织水平上证实了MMP-12在风湿性心脏病患者二尖瓣组织中的表达,为进一步研究MMP-12在风湿性心脏病二尖瓣细胞外基质重塑中的作用及其机制奠定了基础。……   
[关键词]:风湿性心脏病;二尖瓣;基质金属蛋白酶-12
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:昆明医学院2011年
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