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甘草质量评价多指标检测方法的建立及其在不同来源甘草药材鉴别上的应用

刘育辰

  针对在实际应用时如何鉴别不同来源甘草的问题,本文对甘草化学成分进行系统研究,建立了甘草中具有鉴别特征的12种化学成分的含量测定方法和不同来源甘草的指纹图谱,从化学特征的角度鉴别了不同来源的甘草。并提出了甘草质量标准修改建议草案。主要研究成果如下: 1.系统地研究了甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的化学成分。利用多种柱色谱技术,分别对甘草的95%乙醇提取物和50%乙醇提取物进行了分离纯化,共得到36个化合物,鉴定了其中的34个,其中白桦脂酸(6),齐墩果酸(8)为首次从甘草中分离得到,咖啡酸二十二酯(10),7,2 ,4 -trihydroxy-5-methoxy-3-arylcoumarin (20), hedysarimcoumestan B (32), hedysarimcoumestan E (33)为首次从甘草属中分离得到。 2.分别建立了测定甘草中12种化学成分含量的HPLC和UPLC方法。在265nm检测波长下,测定芹糖甘草苷、甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷等4种黄酮苷类成分的含量;分别在350 nm和250 nm检测波长下,测定刺甘草查耳酮、异甘草素licoarylcoumarin、甘草香豆素、华良姜素、甘草醇、格里西轮、甘草酸等8种成分的含量。使用所建立的HPLC和UPLC两种分析方法分别对采自全国各地的100份甘草样品进行含量测定,并对两种测定方法进行比较,统计结果显示两种方法含量测定的结果无显著性差异,均可以准确、可靠的测定甘草中12种成分含量,可以对甘草的质量进行更加全面的评价。但两种测定方法又各具特点,HPLC法能够满足日常应用,UPLC法具有分析时间短、分析效率高等优点,适合高通量分析。 3.分别建立了不同来源甘草的HPLC指纹图谱和UPLC指纹图谱。采用“中药指纹图谱相似度评价软件”对采自全国各地不同来源的100份甘草样品的指纹图谱进行了相似度评价。 4.三种正品甘草的鉴别。确定了区分三种正品甘草的化学成分指标,以及指纹图谱特征。从化学成分角度区分三种正品甘草:通过对100份甘草样本的分析,发现当芹糖甘草苷与甘草苷含量(mg/g)的比值小于2.0时,通常为甘草(Glycyrrh i za ura lens is Fisch.),从而可以把甘草从三种甘草中区分开来,准确率为97.2%;当芒柄花苷与芹糖异甘草苷含量的比值大于0.2时,通常为光果甘草,当芒柄花苷与芹糖异甘草苷含量的比值小于0.2时,通常为胀果甘草,以此可将光果甘草与胀果甘草区分开,准确率为94.7%。另外,licoarylcoumarin、甘草香豆素、华良姜素、甘草醇、格里西轮这5种化学成分存在于甘草中,在胀果甘草和光果甘草中均未检测到,以此可以将甘草从三种正品甘草中区别开来。此外,本文还确定了甘草香豆素为甘草的一种特有成分,并在指纹图谱中指认了该成分的色谱峰。从指纹图谱角度对三种正品甘草进行了鉴别:基于所建三种正品甘草的对照指纹图谱,分别从350nm和250nm两个检测波长下的UPLC指纹图谱以及350nm和250nm两个检测波长下的HPLC指纹图谱中找到三种正品甘草各自的特征色谱峰,从而可以将三种正品甘草区别开。 5.不同生产方式甘草的鉴别。分别从12种化学成分含量及指纹图谱两个角度对内蒙古产野生、半野生、栽培三种生产方式甘草进行了鉴别。12种成分含量比较结果显示:野生和半野生甘草12种成分总含量(均高于50mg/g)均高于栽培甘草(低于45mg/g),但由于样本量稍小,有待于持续样本的考察;三种生产方式指纹图谱相似度评价结果显示:除350nm波长检测下栽培甘草指纹图谱的相似度稍低外,野生甘草和半野生甘草的相似度均良好,250nm波长检测下,三种生产方式甘草的相似度也较好,无法从指纹图谱角度将三者区分。然后又对采自全国8省的栽培甘草与野生甘草分别从12种化学成分含量及指纹图谱两个角度进行了鉴别。12种成分含量比较结果显示:栽培甘草均低于野生甘草。t检验结果表明,芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、芹糖异甘草苷、licoarylcoumarin、甘草香豆素、格里西轮、甘草酸8种成分的含量在栽培甘草和野生甘草药材中均存在非常显著性差异(P<0.01),异甘草素、甘草醇2种成分的含量在栽培甘草和野生甘草药材中均存在显著性差异(P<0.05),刺甘草查耳酮和华良姜素2种成分含量在栽培甘草和野生甘草药材中无统计学意义(P<0.05)。栽培与野生甘草药材的指纹图谱相似度计算结果二者相似度良好,不能从指纹图谱角度将二者区分。 6.不同产地甘草的鉴别。分别从12种化学成分含量及指纹图谱两个角度对不同产地甘草进行了鉴别。采自全国8个产地甘草的12种成分含量差异明显,分别在刺甘草查耳酮和甘草酸的含量上有非常显著性差异(P<0.01)在甘草苷含量上有显著性差异(P<0.05)。通过对不同产地甘草对照指纹图谱进行相似度评价,发现在350nm波长检测下,各地甘草非常接近,无法区分,在250nm波长检测下,除宁夏甘草相似度很低即差异较大外,其他各地甘草对照指纹图谱相似度非常接近,无法从指纹图谱角度将不同产地甘草进行区分。 7.提出了甘草质量标准修改草案。从化学成分特征和指纹图谱两方面提出了鉴别三种不同基源正品甘草的依据,为甘草质量标准的提高提供了参考。 本文的研究特色和创新点: (1)通过对甘草的化学成分进行提取分离,有4个化合物首次从甘草属中分离得到,2个化合物首次从甘草中分离得到; (2)建立了测定甘草中12种化学成分含量的分析方法,可以更加全面的反映甘草的化学信息和内在质量; (3)从化学特征角度鉴别了三种正品甘草,明确了鉴别三种正品甘草的化学方法。……   
[关键词]:超高效液相色谱法;高效液相色谱法;甘草;化学成分;品种鉴别;指纹图谱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:北京中医药大学2011年