手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

蜡梅热激蛋白基因CpHSP1的分子特征、原核表达及其转录的实时荧光定量分析

胡雨晴

  热激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一类能被高温低温激素高盐、干旱以及机械损伤等多种胁迫环境条件诱导而合成的应激蛋白,此蛋白普遍存在于各类生物中,根据分子量的大小可分为HSP100s、HSP90s、HSP70s、HSP60s、smHSPs(small HSPs)五大类,其中以smHSPs最为常见。smHSPs是一类分子量为15-42kDa的HSPs,其分子组成最重要的特点是C端含有一个高度保守的ACD(α-crystallin domain)结构。编码smHSPs的基因均位于细胞核内,分属于6大类,其中2类定位于细胞质,即细胞质Ⅰ类和细胞质Ⅱ类smHSPs,其余4类分别存在于叶绿体(chlorplastid, CP)、内质网(endoplasmic reticulum, ER)、线粒体(mitochondria, Mt)以及过氧化物酶体(peroxisomes, Po)中。smHSPs在细胞内发挥着分子伴侣的功能,参与新生肽链折叠、蛋白质的组装与转运,对植物抵抗、适应胁迫环境以及生长发育起着重要作用。 本论文在实验室已经构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序,得到了1个热激蛋白基因cDNA序列,将其命名为CpHSP1 (GenBank登录号:HQ894379)。在借助生物信息学对该基因进行序列特征和进化分析的基础上,构建了原核表达载体使其在大肠杆菌中实现了异源表达,并探讨了其表达产物在体外极端温度下的相关活性;同时通过转录水平的表达分析,研究了该基因的组织表达情况及其在非生物胁迫处理下的响应特征,主要取得了以下 结果: 1.CpHSP1的分子特征方面 CpHSP1 cDNA全长790 bp,其中开放阅读框为477 bp,编码158个氨基酸。序列结构分析显示:CpHSP1编码蛋白的C端具有小热激蛋白共有的ACD保守结构的2个保守域(Ⅰ和Ⅱ),N端具有细胞质Ⅰ类小热激蛋白特有的保守区,属于细胞质Ⅰ类小热激蛋白。 2.CpHSP1的原核表达方面 构建了CpHSPl的原核表达载体pET32-HSP,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导,得到了与预期一致的分子量为37KDa的融合蛋白。虽然该蛋白的表达不会对适宜温度下大肠杆菌的生长造成影响,但却能够明显提高大肠杆菌在高温和低温的胁迫环境下的存活率。说明CpHSP1的表达产物功能的发挥能够提高细胞对温度的耐受力,在植物体抵抗、适应温度变化的过程中起着重要的作用。 3.CpHSP1表达的转录水平方面 实时荧光定量PCR分析表明:CpHSP1在蜡梅不同组织中有不同程度的表达,茎中的表达量最高;在3轮花器官中的差异也十分显著,花瓣中的表达量明显高于雄蕊和雌蕊,具有较强的组织特异性。CpHSP1在蜡梅单花开放过程中呈现出连续的波动态表达模式,具有较强的时间特异性。高温、低温、高盐、ABA和重金属等非生物胁迫处理后,CpHSP1在蜡梅幼苗叶片中的表达量均明显增加。转录水平的分析结果说明CpHSP1可能在蜡梅生长发育及非生物胁迫应答的过程中发挥着关键的作用。……   
[关键词]:热激蛋白;蜡梅;分子特征;原核表达;荧光定量
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西南大学2011年