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Th17细胞亚群在支气管哮喘中的发病机制及TLR2对Th17细胞分化的调控研究

李开艳

  第一部分Th17和Tc17细胞亚群及其细胞因子白介素17在哮喘小鼠动物模型中的表达研究 【目的】探讨辅助性T细胞17(Th17)和CD8+IL-17+细胞(Tc17)在支气管哮喘小鼠中的比例变化及其意义。 【方法】24只BABL/c小鼠随机分成两组:哮喘组和正常对照组,每组12只,用卵蛋白(OVA)致敏和激发的方法建立小鼠哮喘模型。然后用流式细胞术检测脾脏单个核细胞中Th17细胞和Tc17细胞所占的百分比;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测支气管肺泡灌洗液中细胞因子IL-17的水平;双标免疫荧光检测肺组织中Th17细胞和Tc17细胞的表达。 【结果】哮喘组肺组织炎症改变明显;哮喘组脾脏细胞中Th17细胞比例显著高于对照组(P<0.0001),Tc17细胞比例与显著高于对照组(P<0.001);哮喘组BALF中,IL-17水平显著高于正常对照组(P<0.001);哮喘组BAL中细胞总数和嗜酸性粒细胞数目明显高于对照组(P<0.01);肺组织免疫荧光结果示Th17细胞和Tc17细胞在哮喘小鼠的肺部有表达,主要分布在支气管周围和血管周围,并且数量明显高于对照组(P<0.01)。 【结论】哮喘小鼠的Th17细胞和Tc17细胞数量增多,并且分泌的细胞因子IL-17水平升高,而且哮喘小鼠肺部有较多的Th17细胞和Tc17细胞浸润,提示Th17细胞和Tc17细胞可能参与了哮喘的发病机制。 第二部分Toll样受体2信号对小鼠淋巴瘤EL4细胞系表达白细胞介素(IL)-17影响的研究 【目的】探讨TLR2信号通路对小鼠淋巴瘤细胞系EL4细胞表达分泌IL-17A的影响。 【方法】用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-17A表达水平,实时荧光定量RT-PCR法检测各组细胞中RORyt和IL-17A的:mRNA的表达水平变化。 【结果】TLR2配体可以显著增加细胞IL-17A和RORyt和IL-17A的mRNA的表达,而TLR2抗体可以将这种促进作用抵消一部分,TLR2配体刺激后细胞上清中IL-17A蛋白水平也明显升高。 【结论】Toll样受体2信号对小鼠淋巴瘤EL4细胞系表达IL-17是起促进作用的,这种作用可能是通过促进转录因子RORyt的表达来实现的。 第三部分Toll样受体2信号激活对Th17细胞分化和功能的影响研究 【目的】探讨Toll样受体2信号在调节Th17细胞的分化和功能方面的作用,并且初步探讨参与调控的信号通路机制。 【方法】制作小鼠哮喘模型,免疫磁珠分选CD4+T细胞经体外诱导分化成Th17细胞,细胞分为四组:(1)空白对照组,(2)用TLR2的配体(LTA)激活TLR2信号组,(3)TLR2的抗体阻断TLR2信号组,(4)RORc基因的干扰慢病毒组。然后MTT法检测各组的细胞增殖情况,流式细胞仪检测各组胞内因子IL-17A的水平,ELISA检测各组的细胞上清液中的IL-17A蛋白水平,Real-time RT-PCR检测各组的Th17相关细胞因子(IL-17A、IL-17F和IL-22)的mRNA水平,并检测转录因子RORyt的mRNA水平的变化。 【结果】(1)MTT检测结果示,LTA、LTA+TLR2抗体和LTA+慢病毒都能增加Th17细胞的增殖,与空白对照组比较,P值的大小分别为P<0.05,P<0.001和P<0.01。(2)实时荧光定量PCR结果表明慢病毒感染细胞后可使RORc的mRNA水平下降86%,各组的Th17相关基因(?)nRNA水平检测,LTA组引起IL-17A、IL-17F和IL-22的mRNA水平明显升高(P<0.05),LTA+TLR2抗体组和LTA+慢病毒组上述升高效应又被逆转(P<0.05)。(3)蛋白水平检测胞内因子染色流式分析LTA可以明显刺激增加IL-17A+细胞的百分比,IL-17A+CD8-%由11.7%增加到22.5%(P<0.05)。ELISA检测细胞上清中的IL-17A结果为LTA组引起IL-17A蛋白水平增高(P<0.05),而LTA+TLR2抗体组和LTA+慢病毒组蛋白水平又下降(相比较与LTA组,P<0.05)。(4)TLR2信号对转录因子RORyt mRNA水平的影响:LTA组的RORyt mRNA水平明显增高(P<0.001)。 【结论】TLR2信号能促进Th17细胞的增殖,能增强Th17细胞的功能,并且是通过增加特异性的转录因子RORyt的表达来实现的。 第四部分支气管哮喘患者的血浆IL-21和总IgE水平及其相关性研究 【目的】探讨白介素-21(IL-21)和总IgE在支气管哮喘发病时的血清水平及其两者相关性。 【方法】随机收集哮喘急性发作期患者38例(急性发作组),哮喘缓解期患者23例(缓解组)和健康者19例(对照组)血清,用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测血清IL-21和总IgE水平 【结果】哮喘急性发作期患者血清IL-21水平明显高于正常对照组(P<0.05),急性发作期IL-21明显高于缓解期组(P<0.05),而缓解期和正常对照组差异无统计学意义。血清总IgE水平哮喘急性发作期和缓解期均明显高于正常对照组(P<0.05)。哮喘急性发作期血清IL-21水平和总IgE水平有显著负相关(r=-0.32,P<0.05)。【结论】IL-21可能通过调节IgE的分泌,在支气管哮喘的发病中发挥重要作用。……