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腺性肥大乳房乳腺上皮细胞的体外培养及其增殖与凋亡的相关研究

肖芃

  第一部分腺性肥大乳房乳腺上皮细胞的体外培养 目的探讨腺性肥大乳房乳腺上皮细胞(hMEC-GAHB)的原代培养方法,了解该原代细胞的形态学及生物学特点。 方法采用0.25%胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶混合液,结合长时间4℃和短时间37℃消化,配合低转速离心的方法,从10例腺性乳房肥大症和10例正常体积乳房患者的乳腺组织中消化获取乳腺上皮细胞并进行原代培养,同时传代培养人正常乳腺上皮细胞株HBL-100,评价获取原代细胞的效果,观察各组细胞的形态学特点,采用多抗体免疫细胞化学法(MICC)鉴定原代细胞种属,并采用PI染色法、MTT法和流式细胞术等方法对各组细胞的细胞周期和体外增殖及凋亡等生物学特点等进行分析。 结果每克乳腺组织可获取细胞数约为5×106个,细胞存活率约为70%,接种后48h细胞贴壁率约为60%,贴壁细胞活性良好,接种后约72h胞质展开,约120h相互融合。细胞增殖明显,未见明显凋亡。hMEC-GAHB与另两组细胞在细胞形态学上无明显差异,且正常表达典型的上皮细胞骨架蛋白(CK8/CK14/CK18/a-SMA等)。在含有相同浓度的17β-雌二醇的体外环境中,处于对数生长期的hMEC-GAHB的群体倍增率(PDR)及G2/M期与G0/G1期细胞数比值均高于同期正常体积乳房乳腺上皮细胞(human mammary epithelial cells of normal volumn breast, hMEC-NVB),两者间存在统计学差异(P<0.05)。hMEC-GAHB连续传代3-4次后,逐渐进入衰退期。 结论采用改良的酶消化法可获得较满意的细胞数和细胞活性。hMEC-GAHB具有典型上皮细胞的形态学及生物学特点,在含有雌激素的体外环境中, hMEC-GAHB相比hMEC-NVB具有更强的增殖活力,并具有正常的细胞衰退期。 第二部分腺性肥大乳房乳腺组织和上皮细胞中雌激素受体alpha的定位和表达 目的研究雌激素受体alpha(ERa)在腺性肥大乳房乳腺组织和上皮细胞中的定位和表达,探讨其在腺性乳房肥大症病因学上的意义。 方法对10例腺性乳房肥大症患者和正常体积乳房乳腺上皮细胞进行原代培养,同时传代培养人正常乳腺上皮细胞株HBL-100和人乳腺癌上皮细胞株MCF-7(ERα+),采用免疫组织化学法(IHC)、免疫荧光组织化学法(IFHC)和蛋白质印迹法(western blot)等对乳腺组织病理学特点和组织及细胞中ERα的表达进行定性和定量分析。 结果ERα表达于导管和小叶的腔上皮细胞内,在肌上皮细胞和间质细胞等细胞内几乎不表达,且腺性肥大乳房乳腺组织导管上皮处ERα+细胞数多于小叶,两者比例较为恒定(1.7:1)。ERα+细胞在腺性肥大乳房和正常体积乳房乳腺组织中的阳性表达率(positive expression rate, PER)分别为17.25%和6.13%。腺性肥大乳房、正常体积乳房、正常乳腺上皮细胞株和乳腺癌上皮细胞株中的ERα蛋白表达值(protein expression value, PEV)分别为1.965、1.002、0.060和2.338。腺性肥大乳房乳腺组织中PER和ERαPEV与正常体积乳房及正常乳腺上皮细胞株间均存在明显统计学差异(P<0.05),且PER和ERαPEV与乳房肥大的严重程度呈正相关。乳腺癌乳腺上皮细胞株组各数值与其他各组均存在明显差异(P<0.05)。 结论ERa在乳腺组织内的表达定位具有特征性。与正常体积乳房乳腺上皮细胞(hMEC-NVB)相比,腺性肥大乳房乳腺上皮细胞的阳性表达率(PER)和ERa蛋白表达值(PEV)均明显增高,且ERa表达情况的高低与乳房肥大的严重程度成正相关。由此推测,腺性乳房肥大症的发生与乳腺组织内ERa的分布特点和上皮细胞内ERa表达增多有密切关系。 第三部分他莫昔芬对腺性肥大乳房乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响 目的探讨选择性雌激素受体调节剂他莫昔芬(tamoxifen)对腺性肥大乳房乳腺上皮细胞体外增殖和凋亡的影响,并分析其作用机制。 方法在含有相同浓度17p-雌二醇的体外环境中,给予他莫昔芬分别对腺性肥大乳房乳腺上皮细胞(hMEC-GAHB) (M1组)、正常乳腺上皮细胞株HBL-100(N’组)和乳腺癌上皮细胞株MCF-7(ERα+)(C组)进行干预,并设立hMEC-GAHB对照组M2组,采用PI染色法检测细胞周期,免疫细胞荧光法(IFCC)、MTT法和Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测各组细胞增殖和凋亡情况,同时采用蛋白质印迹法(western blot)和real-time RT-PCR技术对干预后hMEC-GAHBERa的蛋白表达变化和ERαmRNA的扩增变化进行定性和定量分析。 结果干预后,镜下见hMEC-GAHB小部分细胞的细胞核固缩、碎裂,凋亡小体及微核出现。随时间的变化,hMEC-GAHB干预组M1组的群体倍增率(PDR)明显下降,凋亡细胞数增多,其细胞凋亡率介于正常乳腺上皮细胞株和乳腺癌上皮细胞株之间。G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例上升,细胞周期阻滞在G0/G1期。ERa蛋白表达减少,ERαmRNA扩增倍数减小,基因表达下调。而hMEC-GAHB对照组M2组ERa的蛋白表达值和ERαmRNA基因扩增倍数增加。 结论他莫昔芬能阻断雌激素对ERa+细胞的激动作用,诱导ERα+细胞凋亡,明显抑制肥大乳房乳腺上皮细胞的生长增殖,减少细胞内ERa的表达,下调ERamRNA的基因表达,且诱导凋亡作用呈现时间依赖性。而对ERa-细胞无明显影响。由此推测他莫昔芬可竞争性拮抗雌激素与ERa的结合,其诱导凋亡靶细胞主要为ERα+乳腺上皮细胞,其机制可能是通过对ERa基因水平的调控发挥作用。……   
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