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姜黄素联合人类细胞因子诱导的杀伤细胞对卵巢癌细胞增殖的抑制及机制的研究

单延红

  卵巢癌是妇女第五大癌症死亡原因,是妇科癌症首要死亡原因,一生当中大约每58个妇女就有一个患卵巢癌。由于卵巢位于人体内部,卵巢癌早期无明显症状,发现时多已为晚期。主要采用手术切除及顺铂联合紫杉醇进行化疗。细胞减灭术提高晚期患者生存率的作用有限,而化疗副作用很大,对于Ⅲ、Ⅳ期的病人在一线治疗后平均存活期大约为18个月。一些晚期患者由于身体素质差,不能耐受化疗。因此,临床上需要更好的辅助治疗方法,延缓复发和提高卵巢癌患者的生存率。 过继免疫治疗作为肿瘤生物治疗的一种模式,通过输注免疫活性细胞以增强肿瘤患者的免疫功能,为晚期卵巢癌患者,尤其是复发的卵巢癌患者及身体素质差,不能耐受化疗的患者提供了新的治疗途径。 人类细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer,CIK),是体外由不同的细胞因子如CD3单克隆抗体,IL-2,IL-1和γ-干扰素等诱导的免疫效应细胞,大量实验研究及临床试验表明,CIK细胞作为一种过继免疫治疗因子能够有效抑制和杀伤肿瘤细胞,与手术或放、化疗结合,可以防止癌的扩散和复发。但CIK细胞与中药相结合抗肿瘤的研究,国内外鲜有报道。姜黄素(Curcumin,Cur)是从姜科植物姜黄的根茎中提取的有效成分之一,有广泛的药用价值,抗癌是其主要的作用之一。 本研究通过观察CIK细胞联合Cur对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用及对细胞凋亡的影响,探讨二者联和使用是否具有协同抗肿瘤作用,从而强化CIK细胞作为过继免疫治疗的优势,并探讨其可能的作用机制,为卵巢癌细胞的免疫治疗及中药治疗提供实验研究,为卵巢癌的综合治疗提供一个新的治疗思路,为进一步临床应用奠定基础。 方法: 首先诱导脐血CIK细胞,将SKOV3细胞随机分为Cur组、CIK细胞组、Cur联合CIK细胞组,MTT法测定各组细胞的增殖抑制率,并进行联合应用效应计算;电镜下观察各组细胞凋亡形态,流式细胞仪检测细胞凋亡,RT-PCR检测各个给药组对SKOV3细胞FAS,FADD,CASP3mRNA表达的影响,Weston blot检测Cur作用后卵巢癌细胞表面Fas表达及CIK表面FasL的表达,MTT法检测抗FasL单克隆抗体对CIK细胞及Cur联合CIK细胞对卵巢癌细胞增殖抑制率的影响。 结果: (1)实验中选择较低浓度的CIK与Cur,其单独作用于SKOV3细胞,抑制率均较低,而二者联合应用后能明显促进对增殖的抑制,且随着药物浓度及效耙比增加及作用时间的延长,抑制率也逐渐增加,即呈时间和浓度依赖关系。在效靶比为12.5:1,Cur浓度为20μmol·L-1时,作用48小时,单独应用的抑制率分别为48.7%及41.9%,而二者联合应用后抑制率达到76.2%,为单独应用的1.6倍及1.8倍。且联合应用效应Q值显示:Cur与CIK细胞合用作用于SKOV3细胞后Q值均大于或等于1.2,进一步证明二者合用具有协同抗肿瘤效应。 (2)透射电镜显示:对照组卵巢癌细胞大小不等,细胞表面可见少量微绒毛,可见细胞分裂相和多核巨细胞。而各个给药组作用24h后,均呈现典型的细胞凋亡的形态学改变,Cur联合CIK组细胞凋亡的形态学改变最明显,Cur组细胞大小不等,胞质内多见电子致密物,部分细胞线粒体和粗面内质网成泡状改变,胞质内可见空泡结构,核内特染色质增多,成块状;CIK组细胞大小不等,细胞膜微绒毛减少,少量细胞膜有破损,胞质内可见较多的空泡结构和电子致密物,线粒体空泡样改变;Cur联合CIK组细胞大小不等,细胞数明显减少,细胞膜有破损,少见多型核巨细胞,胞质内可见大量的空泡结构或电子致密物,线粒体脊断裂或呈空泡样改变,细胞核固缩。表明Cur与CIK联用具有明显诱导SKOV3细胞凋亡的作用。 (3) RT-PCR检测CIK细胞、Cur、及Cur联合CIK对SKOV3细胞内Fas的mRNA表达影响。结果显示,与对照组相比,DMSO和Cur组对Fas的mRNA表达无影响,而CIK细胞组和Cur联合CIK组能够促进FAS的mRNA表达(P<0.05),表达阳性率分别为对照组的120%及186%;Cur联合CIK组FAS的mRNA表达明显增加,为CIK细胞组的1.55(186/120)倍;与对照组相比,各个给药组对FADD的mRNA表达无影响;与对照组相比,DMSO对Caspase3的mRNA表达无影响,而Cur组、CIK细胞组和Cur联合CIK组均能够促进Caspase3的mRNA表达(P<0.05),表达阳性率分别为对照组的115%、205%、302%,且Cur联合CIK组Caspase3的mRNA表达明显增加,分别为Cur组及CIK细胞组的2.62(302/115)倍及1.47(302/205)倍。 (4) Weston blot检测Cur作用后卵巢癌细胞表面Fas表达。结果显示,与对照组相比,DMSO对Fas蛋白表达无影响,而5、10和20μmol·L-1 Cur能够促进SKOV3细胞Fas蛋白表达(P<0.05)。表达阳性率分别为对照组的168%,253%及249%。 (5) Weston blot检测Cur对CIK细胞膜FasL蛋白表达的影响。结果显示,与对照组相比,DMSO对FasL蛋白表达无影响,而5、10和20μmol·L-1 Cur能够促进CIK细胞膜FasL蛋白表达(P<0.05),表达阳性率分别为对照组的139%,142%及138%。 (6)MTT检测抗FasL单克隆抗体对卵巢癌细胞增殖抑制率的影响。通过FasL抗体预先孵育,阻断了Fas/FasL途径,CIK组和Cur联合CIK组FasL抗体预先孵育能够明显抑制对SKOV3细胞的增殖抑制作用。抑制率分别由31.4%降至21.1%,69.8%降至51.6%。 结论: (1)脐血来源的CIK细胞体外增殖快,单个核细胞提取率高,对卵巢癌SKOV3细胞杀伤活性强。可方便地用于临床治疗。 (2)Cur与CIK细胞联合使用,作用于卵巢癌SKOV3细胞,体外具有协同抗肿瘤效应。作为一种辅助治疗手段,为肿瘤患者,尤其是复发的及不能耐受化疗的晚期肿瘤患者带来了希望。 (3)Cur与CIK细胞联合使用,诱导SKOV3细胞凋亡作用增强,表明二者合用具有较好的肿瘤治疗效果,有希望成为发展前景良好的综合治疗方法。 (4)Cur与CIK细胞联合使用,诱导卵巢癌细胞凋亡的机制可能为Cur促进SKOV3细胞表面Fas表达增强,CIK细胞表面FasL表达增强,从而使SKOV3细胞内Fas表达增加,最终使caspase3表达增高。为二者的进一步临床应用提供了理论依据。 本研究将Cur与CIK细胞联合使用,作用于卵巢癌SKOV3细胞,增强了对SKOV3细胞的增殖抑制作用,强化了CIK细胞作为过继免疫治疗的优势,为晚期卵巢癌患者,尤其是复发的卵巢癌患者及身体素质差,不能耐受化疗的患者提供了新的治疗途径。为卵巢癌的综合治疗提供一个新的治疗思路:在卵巢癌治疗的具体方案设计上可采取多种方法联合应用综合治疗。……   
[关键词]:姜黄素;CIK;卵巢癌细胞;增殖抑制;细胞凋亡
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2011年