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复苏后多器官功能障碍家兔模型脏器功能损伤机制的研究

李南

  实验目的: 采用窒息法建立兔心搏骤停心肺复苏后多器官功能障碍综合征模型,探讨PR—MODS模型在炎症反应、细胞凋亡、离子通道及线粒体损伤方面的变化规律,拟从细胞学、分子学及离子通道水平探讨PR—MODS形成的机制及疾病的演变规律,完善PR—MODS模型造模体系,多方位评估模型的可行性,以期找到更好的治疗切入点,加强对PR—MODS的救治,最终改善心搏骤停患者的预后。 实验方法: 健康成年清洁级中华大耳白兔66只,体重2.0—2.5kg,雌雄不拘,随机分为3组。实验兔由吉林大学白求恩医学部动物实验中心提供,耳、鼻、眼无异常分泌物,毛色光泽,反应敏捷。实验前笼内饲养,术前不禁食水。 第一组10只,摸索改良窒息法致家兔心搏骤停复苏后多器官功能障碍综合征动物模型的窒息时间。比较家兔窒息致心搏骤停后非干预时间为3分钟和4分钟的两组48h生存率的差别。 第二组28只家兔非干预时间为3分钟,建立模型。随机分为4组,每组7只,分别于窒息前(假手术组)、12h、24h、48h处死,留取心、脑、肺、肾、肝等脏器组织,采用免疫组化法观察主要脏器Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表达规律;采用透射电镜和TUNEL法观察复苏后心肌细胞的超微结构改变及凋亡情况。7只48h处死组的模型兔于手术后复苏前、复苏后3h、6h、12h、24h、48h等6个时间点抽取动脉血,按ELISA试剂盒说明书进行检测IL—6和IL—10水平;以黄嘌呤氧化酶法测定血清SOD总活力;用硫代巴比妥酸法测定血清MDA含量。 第三组28只家兔非干预时间为3分钟,建立模型。随机分为4组,每组7只,分别于窒息前(假手术组)、复苏后3h、12h、24h取出心脏进行心脏灌流,分离心肌细胞制备单细胞悬液,行线粒体膜电位(ΔΨm)检测,同时利用全细胞膜片钳技术观察兔PR-MODS模型不同时间点心室肌细胞动作电位(AP)、L型钙通道电流(ICa-L)、延迟整流钾电流(IK)的变化。 实验结果: 1.达到心搏骤停标准时,10只家兔有1只出现室颤(10%),6只表现为无脉性电活动(60%),3只表现为全心停搏(30%)。10只家兔自主循环全部恢复,ROSC率为100%,自主循环恢复时间为284.8±24.07秒。6h存活率为80%;12h存活率为60%;24h存活率为60%(4只心搏骤停3分钟后复苏组,2只心搏骤停4分钟后复苏组);48h存活率为50%(4只心搏骤停3分钟后复苏组,1只心搏骤停4分钟后复苏组)。 2.复苏后血清IL-6水平开始升高,6h达到高峰(P<0.01),后逐渐下降,12h水平已低于窒息前,至48h最低(P<0.01)。 复苏后血清IL-10水平开始升高,3h达到高峰(P<0.01),后逐渐下降,12h、24h、48h与窒息前比较P>0.05。 IL-6/IL-10比值在复苏后低于窒息前,3h值最低,但各组间差别无统计学意义。 3.复苏后血清SOD总活力开始降低,6h达到最低值,后逐渐升高,但直至48h血清SOD总活力仍低于窒息前。 复苏后血清MDA含量开始升高,12h达到高峰,后逐渐下降,但直至48hMDA含量仍高于窒息前。 4.复苏后Bcl-2蛋白最初开始升高,心、肺和肝脏于12小时达峰值,之后下降;而脑和肾脏则在复苏后24小时Bcl-2蛋白表达最高达峰值,之后下降。Bax蛋白在复苏后12小时各脏器均显著增高,直至本实验观察的最长时间48小时,Bax蛋白表达持续升高达峰值。复苏后12h组各脏器caspase-3蛋白表达明显高于假手术组,之后继续升高,复苏后48h组各脏器caspase-3蛋白表达达到高峰。 5.通过TUNEL检测,假手术组各脏器偶有TUNEL阳性细胞,心肺复苏后12小时各脏器细胞出现明显凋亡,24h、48h继续升高,48h组达到本研究观察时间内的最高计数值。在研究的5个脏器中心肌凋亡指数最高,其次是脑和肺,肾脏和肝脏的细胞凋亡程度较轻。 6.应用激光共聚焦显微镜检测兔各组心肌细胞ΔΨm,假手术组ΔΨm为129.42±29.29(RFU),复苏后3h组AΨm急剧下降达到13.67±2.88(RFU),复苏后12h组△甲m为15.79±3.73(RFU),后逐渐回升,复苏后24h组ΔΨm为43.50±2.55(RFU)。3h与12h两组数据无统计学差异,其余各组之间均有统计学差异。 7.复苏后3h组动作电位(AP)较假手术组组有所下降,但差异无统计学意义;12h组AP变化最显著,明显低于对照组;24h组与12h组比较,AP有所恢复,但与对照组比较仍有显著差异。 复苏后3h组ICa-L较假手术组有所下降,但差异无统计学意义;12hICa-L变化最显著,明显低于假手术组,有统计学意义;24hICa-L与12h比较有所升高,但与假手术组比较仍较低,但差异均无统计学意义。复苏后早期钙通道受到抑制,表现为ICa-L电流密度(pA/pF)较正常心肌细胞明显下降。 复苏后随着时间的延长至24h,IK逐渐下降,3h组与12h组与假手术组比较,差异无统计学意义,24h降低较前明显加剧,与假手术组比较差异有统计学意义。 8.电镜下复苏后12h组超微结构损害最重,可见各器官细胞染色质聚集,细胞核固缩,线粒体代偿性增生、嵴断裂、空泡性改变,间质内炎症细胞浸润,毛细血管内皮细胞基底膜破坏;之后,模型的各脏器细胞超微结构损害逐渐减轻,至48小时,肝、肾的细胞形态已恢复接近正常状态,肺脏细胞仍存在轻度的超微结构的损伤,心肌和脑细胞损伤仍较重。在研究的5个脏器中心肌、脑和肺超微结构损害重,肾脏和肝脏的细胞损害程度较轻。 结论: (1)窒息法致心搏骤停PR-MODS模型方法可靠,从模型脏器的病理形态改变、炎症反应、线粒体损伤程度、凋亡及凋亡相关蛋白表达程度等多方面均达到多器官功能障碍标准。非干预时间定为3分钟,造模成功率高,效果确切,可重复性佳。 (2)复苏后IL—6/IL—10逐渐升高,促/抗炎细胞因子平衡被破坏,导致PR-MODS。 (3)复苏过程中全身脏器缺血再灌注导致了细胞凋亡,细胞凋亡是复苏后脏器功能障碍的重要原因。在研究的5个脏器中心肌、脑和肺细胞凋亡超微结构损害重,肾脏和肝脏的细胞凋亡及细胞损害程度较轻。各器官损伤于复苏后12小时最重,之后逐渐好转。 (4)心肺复苏后直至48h,心肌细胞动作电位幅度与动作电位时程均下降,ICa-L及IK均受到抑制,易导致心律失常及加重心脏衰竭。 (5)复苏后心肌细胞ΔΨm及血清SOD活力、MDA含量变化显著,细胞线粒体功能显著受损,导致脏器功能严重损伤,发生PR-MODS。……   
[关键词]:心搏骤停复苏后多器官功能障碍综合征;炎症因子;凋亡;离子通道;线粒体损伤
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2011年