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川芎嗪对庆大霉素耳肾毒性保护作用的研究

李慧

  目的: 氨基糖苷类抗生素(AGs)是由微生物产生或经半合成制取的一类由氨基糖或中性糖与氨基环醇的苷键相结合易溶于水的碱性抗生素。其作用机制主要是抑制细菌蛋白质的合成,肌注后大部分经肾脏以原型排出,引起可逆或不可逆的前庭、耳蜗及肾脏的损害,其耳肾毒性已经成为该药用于人类的一个主要问题。 本研究通过应用免疫组织化学技术观察中药川芎嗪(TMP)干预庆大霉素(GM)中毒后豚鼠耳蜗和肾脏5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)阳性标记细胞在组织中的定位和分布,并结合听脑干诱发反应(ABR)测试从功能和形态验证中药TMP能否促进GM中毒后豚鼠耳蜗毛细胞和肾脏组织的增殖(即再生),并通过透射电镜观察耳蜗增殖细胞的来源;应用PCR观察中药TMP干预GM中毒后豚鼠肾脏mtDNA缺失的情况,探讨TMP促进受损细胞再生的保护作用。 方法: (1)实验动物分组及给药 耳廓反射灵敏的健康豚鼠(白色红目)40只,体重200—330g,雌雄不限,随机分成四组(每组10只)。庆大霉素(GM)组:连续10日每日腹腔注射GM100 mg/kg;中药川芎嗪+庆大霉素(TMP+GM)组:连续10日每日左侧腹腔注射GM 100mg/kg,右侧腹腔注射TMP140mg/kg;中药川芎嗪(TMP)组:连续10日每日腹腔注射TMP注射液140mg/kg;生理盐水对照(Control)组:连续10日每日腹腔注射生理盐水2.5ml/kg。四组动物常规饲养,每日测量体重调整药量。停药后1天处死动物,处死豚鼠前6小时腹腔注射BrdU (100mg/kg体重)。 (2)实验检测以下内容 ABR阈值检测;耳蜗冰冻切片以及肾脏石蜡包埋切片的BrdU的检测;透射电镜观察耳蜗毛细胞的情况;采用巢式PCR检测肾脏组织中mtDNA的缺失。 结果: (1)中药TMP干预GM耳中毒后耳蜗ABR阈值变化的测定结果 用药前各组ABR阈值差异无显著性(P>0.05),用药后GM组ABR阈值明显升高,且与对照组比较差异显著(P<0.01)。GM+TMP组ABR阈值虽然在用药后也有增高,但较GM组明显降低(P<0.05)。TMP组和对照组ABR阈值在用药前后变化不明显(P>0.05),见表3.1。 (2) BrdU掺入的免疫组化结果 1) BrdU掺入的耳蜗毛细胞的免疫组化结果 光镜下观察耳蜗毛细胞,BrdU在正常对照组和TMP组均着色最浅,GM组居中,GM+TMP组最深,呈强阳性表达(图3.1)。图像分析表明,正常对照组和TMP组BrdU的灰度值均明显高于另两组(P<0.05), GM+TMP组灰度值低于GM组(P<0.05),见表3.2。 2) BrdU掺入的肾脏组织的免疫组化结果 光镜下观察肾脏组织,BrdU在正常对照组和TMP组均着色最浅,GM组居中,GM+TMP组最深,呈强阳性表达(图3.2)。图像分析表明,正常对照组和TMP组Brdu的灰度值均明显高于另两组(P<0.05), GM+TMP组灰度值低于GM组(P<0.05),见表3.3。 (3)透射电镜观察耳蜗毛细胞形态学变化 GM组:停药后1天豚鼠耳蜗毛细胞细胞核膜皱缩、凹陷,核染色质固缩、凝集、染色质边聚,线粒体空泡样变性(图3.3-B);TMP+GM组:停药后1天豚鼠耳蜗毛细胞的损伤程度较GM组为轻,毛细胞细胞体及核的形态基本正常,空泡样变较少(图3.3-C)。因此,TMP具有降低GM的耳毒性,减轻耳蜗组织损伤的作用。我们在停药后TMP+GM组的豚鼠耳蜗可见新发现细胞,它由基底膜的基底面和受损伤的感觉上皮中间层向腔面细胞层移行。其胞质中有吞噬泡;胞核形态卵圆形或不规则。位于受损伤的感觉上皮腔面细胞层的新发现细胞游离面可见微绒毛,与周围细胞存在紧密连接(图3.4)。 (4)豚鼠肾脏mtDNA4568缺失的检测 结果显示GM+TMP和GM组的电泳结果可见清晰的404bp条带(图3.6),说明两组均有mtDNA缺失;比较mtDNA4568缺失的发生率显示GM组的缺失率高于GM+TMP组,(χ2检验,P<0.05),见表3.4。 讨论: GM属于AGs,是广谱抗生素。能抗革兰氏阴性细菌。它是一种耳肾毒性药物,能够导致感音神经性耳聋和肾损伤。TMP是从具有“血中气药”之称的活血化瘀中药川芎中提取出的有效单体,目前在临床上广泛用于治疗兼有血瘀证候的各种疾病。中药TMP对羟自由基有明显的清除作用,可降低卡那霉素引起的豚鼠耳蜗组织中自由基的产生,改善听力。 本研究首先在实验中观察了TMP对GM耳中毒豚鼠听力的影响,结果表明TMP使GM耳中毒豚鼠ABR阈值明显降低,提示TMP能显著降低GM耳毒性损伤而使听力得以改善。倪月秋等人通过扫描电镜观察发现:GM耳中毒豚鼠停药后30天耳蜗第二转内外毛细胞静纤毛与正常对照组相比未见明显差异。同时,耳蜗第三转有新生的静纤毛出现,认为庆大霉素损伤后的毛细胞可以再生。 本实验在引入外源性BrdU后,经过免疫组化染色后,数码相机拍照,图像经形态学分析软件处理后结果显示TMP可促进耳蜗毛细胞和肾脏组织细胞的增殖(再生)。而透射电镜也证明TMP具有降低GM的耳毒性,减轻耳蜗组织损伤的作用。 我们在停药后听TMP+GM组的豚鼠耳蜗可见新发现的细胞,由基底膜的基底面和受损伤的感觉上皮中间层向腔面细胞层移行。其胞质中有吞噬泡;胞核形态卵圆形或不规则。位于受损伤的感觉上皮腔面细胞层的新发现细胞游离面可见微绒毛,与周围细胞存在紧密连接(图3.5)。 综上所述,本实验表明GM通过使mtDNA的缺失而产生耳肾毒性,使耳蜗毛细胞和肾脏组织损伤,产生耳肾毒性;TMP通过其减少活性OFR的产生等作用,有效的降低GM耳中毒豚鼠的听阈,有效的降低GM耳肾毒性损伤,并促进受损耳蜗毛细胞的增殖,为阐明并完善AGs耳肾毒性机制及TMP干预药物中毒性细胞损伤修复机制提供理论基础,并为开发新药寻找新靶点。……   
[关键词]:川芎嗪;庆大霉素;药物毒性;耳蜗;毛细胞;再生;肾脏;线粒体NDA
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林大学2011年