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Paraconiothyrium variabile GHJ-4漆酶的发酵、分离纯化及其酶学性质的研究

王维乐

  漆酶(Laccase,EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶,具有广泛的底物,不仅能催化氧化多种芳香族化合物,还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质如苯氧基类除草剂等的毒性,还可以使多种染料脱色及去除石油工业废水的毒性;因此在造纸、环保、食品、医药卫生、生物检测等领域具有较大的研究和应用价值。鉴于此,以本实验室筛选到的一株高产漆酶菌株Paraconiothyrium variabile GHJ-4 (简称:GHJ-4)为研究对象。采用统计学方法对GHJ-4菌株产漆酶的发酵培养基及发酵条件进行了优化,并进一步对菌株GHJ-4所产漆酶进行了分离纯化及其酶学性质的研究,主要内容如下: 1.通过摇瓶培养,结合统计分析方法研究了发酵培养基和发酵条件对GHJ-4产漆酶活性的影响。 通过单次因子试验和正交试验确定了发酵培养基的最佳碳源、氮源、碳氮比、无机盐。在此基础上,通过响应面法对发酵培养基进行优化,首先采用Plackett-Burman(PB)试验设计筛选出了影响该菌产漆酶的三个重要因素:可溶性淀粉、牛肉浸膏和CuSO_4;继而采用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,并结合中心组合试验以及响应面分析,建立了以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,从中获得了最佳发酵培养基为:麸皮30 g/L,可溶性淀粉58.08 g/L,牛肉浸膏3.39 g/L,NaNO_3 1 g/L,KH_2PO_4 3 g/L,CuSO_4 0.554 g/L。 在优化后发酵培养基的基础上,结合统计分析方法对发酵条件经了优化,首先用PB法筛选出四个影响较大的因素,即接种量、培养时间、装样量和转速;继而采用最陡爬坡试验逼近最大响应区域,并结合中心组合试验以及响应面分析,建立了以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,从中获得了最佳发酵条件为:接种量6.43%(v/v),温度28℃,初始PH 4,培养时间182 h,装液量72.5 mL/250 mL,转速157 r/min,种龄96 h。 采用最佳发酵培养基和发酵条件,供试菌株的漆酶酶活达到710.44 U/mL,较优化前漆酶的产量提高了16.4倍,其试验值与预测值基本相符,说明预测模型可靠性高,可应用于漆酶发酵条件的优化。 2. GHJ-4漆酶的分离纯化及其酶学性质 菌株GHJ-4液态发酵所产的漆酶通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-sepharose Fast Flow阴离子交换树脂、Sephadex G-75分子筛柱层析三步分离纯化后,得到电泳纯的漆酶,纯化倍数为8.1倍,回收率为24.2%,其分子量约53 kDa。 纯化后的漆酶最适温度和最适pH分别为50℃和5.0,该酶在55℃以下pH3.5~6.5范围内较为稳定;Cu~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)对漆酶酶活有明显促进作用,而Hg~(2+)、Fe~(3+)、Ag~+对漆酶酶活有显著抑制作用。以愈创木酚为底物时,测定该酶的米氏常数Km值为62.07μmol/L,最大反应速度Vmax为68.97 mmol/(L·min)。……   
[关键词]:Paraconiothyrium variabile GHJ-4;漆酶;发酵;分离纯化;酶学性质
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2011年
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