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鼻气管鸟杆菌的分离鉴定及致病性研究

吴海洋

  鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale, ORT)是一种不运动、高度多形性、无芽孢的革兰氏阴性(G-)小杆菌。在血液琼脂上生长缓慢,5%-10%CO2条件下,于5%绵羊血液琼脂37℃恒温培养24h后可形成针尖大小、不溶血的灰白色圆形菌落。培养48h后可形成圆形、灰色到灰白色奶酪状的直径为1-3mm的小菌落,有时颜色稍变浅红并发出类似酪酸的气味。临床上以呼吸道症状、生长障碍、死亡率增加为特征,病理上以严重的单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎、气囊炎为特征。目前,该病在欧洲、美洲、南非的许多发达国家流行,并呈上升的趋势,严重危害养禽业的发展,因此,应引起人们的广泛注意。我国陈小玲等首次在国内分离到2株ORT,但是还未见从山东省分离到该菌的报道,本课题应用生化试验和PCR方法首次从山东省的商品肉鸡中分离到5株ORT,并通过不同途径感染雏鸡,探讨ORT对雏鸡的致病性和体内抗原的分布,为更好的控制本病提供理论依据。 本试验采集山东省不同地区有呼吸道症状的病死鸡进行鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale ,ORT)的分离,根据培养特性、生化试验和玻片凝集试验对分离的菌株进行鉴定。应用PCR方法对分离菌株16S rRNA基因的一段保守序列进行扩增,应用琼脂扩散沉淀试验(AGP)对分离菌株的血清型进行鉴定,并对分离株进行药敏试验。试验共分离到5株ORT,所有分离菌株均能扩增到一段671bp的特异性片段,而阴性对照菌株的扩增结果为阴性;5株ORT分离菌株可分为3个血清型,其中血清A型3株,血清B型1株,血清D型1株;分离ORT菌株对羟氨苄青霉素、头孢曲松、丁胺卡那、氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。 选择1株血清A型ORT分离菌株分别通过气管、消化道和肌肉注射接种途径人工感染肉雏鸡和SPF雏鸡,观察试验鸡的发病情况及症状,称量各试验组和对照组的增重;利用建立的PCR检测方法对试验组和对照组排菌情况进行动态观察;于感染后不同时间随机剖杀试验组和对照组鸡只,采集心脏、肝脏、肺脏和气管等组织固定、切片、H.E.染色,观察各器官病理组织学变化,利用建立的IFA方法对ORT在雏鸡体内的分布进行研究,并进行血常规和血液生化指标检测。ORT接种后,引起雏鸡的呼吸困难、咳嗽等症状,增重明显降低;病理组织学变化以肝脏、心脏组织细胞变性、坏死,气管和肺脏广泛性出血和炎性细胞浸润为特征;IFA阳性信号主要分布于肺脏和气管;从感染后的第2d到第8d一直可持续排菌;HGB、WBC、RBC、BUN和AST发生显著变化。 以1株ORT分离株免疫清洁级新西兰白兔,高免血清经辛酸-硫酸铵法和葡聚糖G200柱纯化,制得第一抗体。以FITC标记的山羊抗兔IgG为第二抗体,通过反应条件的优化,建立了ORT间接免疫荧光(IFA)快速诊断方法。试验结果表明:一抗的最佳稀释度为1:25,感作时间为4℃过夜,二抗的最佳工作浓度为1:200,感作时间为37℃1h,ORT特异性黄绿色荧光最清晰。应用建立的IFA对ORT人工感染雏鸡的各组织器官进行检测,气管、肺脏、肝脏、心脏均可检测到ORT,其中气管和肺脏检出率最高,表明这两个器官是ORT的主要靶器官。研究表明本法用于ORT的诊断具有简单、快速、特异性强等特点,是对ORT进行检测和抗原定位的良好方法。……   
[关键词]:鼻气管鸟杆菌;分离鉴定;致病性;间接免疫荧光;抗原定位
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2011年