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产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测

王苗利

  为了认识α毒素在感染产气荚膜梭菌动物体内的分布,深入探讨产气荚膜梭菌的肠源毒血症的致病机理,本实验自制了高效价的产气荚膜梭菌α毒素的多克隆抗体,并以此作为一抗采用免疫组织化学方法对人工感染产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位,阐明了产气荚膜梭菌毒素的分布状况,揭示了家畜猝死症的致病机理。首先在厌氧条件下培养复活了A型产气荚膜梭菌标准菌株,提取DNA模板,设计特异性的引物,并对其α毒素的全长基因进行PCR扩增、克隆。以常规基因重组技术,将回收的目的基因片段插入原核表达载pET28a,得到重组质粒,经酶切、测序鉴定后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),转化完成后,用IPTG诱导表达,摸索诱导最优条件后,将最佳条件下的诱导产物进行SDS-PAGE电泳,并经镍柱亲和纯化目的蛋白;PBS透析,Western blot检测了蛋白的特异性。 将表达并纯化的α毒素蛋白500μg混以免疫弗氏佐剂免疫家兔四次,定期取血清并用ELISA方法检测抗体滴度,获得多克隆抗体。 将产气荚膜梭菌接种产毒培养基,厌氧环境45C、4h培养,取培养液常规硫酸铵法提取外毒素,用灭菌生理盐水稀释,腹腔皮下注射小鼠,取72h内死亡小鼠的器官组织:心、肝、脾、肺、肾、胃,小肠、延脑,投入4%多聚甲醛中固,然后制作组织切片,用自制的兔抗α毒素多克隆抗体作为一抗,HRP(辣根过氧化物酶)和FITC(荧光素)分别标记的羊抗兔IgG,作为二抗。通过免疫组织化学法对患产气荚膜梭菌病的小鼠体内的α毒素进行了定位检测。 结果表明,PCR扩增出长度为1228 bp的产物,通过Blast比对,确认为α毒素基因;对表达载体pet28a和含有目的基因的重组T载体分别进行双酶切,并将酶切后的线性pet28回收产物和酶切后的目的片段回收产物进行连接,成功构建了pet28a-α表达载体。经IPTG诱导、表达产物经SDS-PAGE电泳,获得大小为45KD特异的表达条带,表达量可达42.1%。Western blot结果证明表达的目的蛋白具有高度的特异性。 以表达的α毒素蛋白为抗原,四次免疫家兔后,获得得多克隆抗体经ELISA测定,其效价为1 : 512,000。经免疫组织化学法对器官的毒素分布检测指出,在小鼠的延髓、肠、肾、肺、胃的组织细胞胞浆中发现了阳性颗粒,说明α毒素随血液循环系统进入并侵害了动物的延髓、肠、肾、肺、胃等组织。在脾、肝的血管内发现阳性颗粒,但在主质细胞中未发现毒素分布,说明毒素无法侵害脾肝的主质细胞。研究显示,本实验成功的制备了高效价的兔抗α毒素多克隆抗体,免疫组化结果提示,首次在延髓的细胞胞浆中发现了α毒素,延髓是生命中枢、呼吸、心血管中枢,毒素的侵害使其紊乱,加之毒素对消化系统呼吸系统及肾脏的毒害作用,导致动物死亡。……   
[关键词]:产气荚膜梭菌;α毒素;家畜猝死症及其机理;多克隆抗体;免疫组化;HRP标记;FITC标记
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2011年
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