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两个马铃薯Y病毒分离物全基因组序列测定及抗病毒dsRNA表达载体的构建

贾金磊

  马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是我国烟草上的主要病毒。甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)引起玉米矮花叶病,严重影响我国玉米产量。 从山东烟草上分离得到2个PVY分离物AQ4(JN083841)和FZ10(JN083842),在烟草上引起花叶或斑驳。测定两个分离物的全基因组序列,发现AQ4和FZ10均为N和O株系分离物的重组体。AQ4分离物1-496 nt和2497-9700 nt来源于PVYO株系的分离物Oz,497-2496 nt来源于PVYN株系的分离物CH-605。FZ10分离物1-496 nt和2497-6533 nt来源于PVYO株系的分离物SASA-110,497-2496 nt和6534-9698 nt来源于PVYN株系分离物CH-605。系统进化分析表明,AQ4属于PVYN:O亚组, FZ10属于重组的PVYNTN亚组。以前报道HC-Pro上D205、K400和E419氨基酸决定PVY烟草上引起坏死,FZ10的HC-Pro含这三个位点,但在烟草上引起花叶,这说明可能还有其它基因或位点决定PVY在烟草上引起坏死。 选择PVY、CMV和TMV的核苷酸序列中适合siRNA形成的保守区域,以AQ4和实验室克隆的TMV、CMV cDNA为模板,从PVY CP、CMV RdRp和TMV CP基因上分别扩增了300 bp、250 bp和450 bp的片段。以TMV片段中部分序列作为间隔区域,将三个片段连接后以反向重复方式插入pGEM-T Easy载体,得到dsRNA表达载体。将载体导入RNaseⅢ缺失的大肠杆菌菌株HT115(DE3),诱导表达后获得dsRNA。使用表达dsRNA的细菌培养液破碎后处理三生烟(N.tabccum cv.Samsun),然后接种病毒,发病率下降明显,表明dsRNA培养液有良好的抗病毒效果。 通过对NCBI上SCMV全基因组序列的分析,选取了位于CI、NIb和CP基因的适合siRNA形成的保守序列。以SCMV cDNA为模板扩增得到这三个片段后通过融合PCR将三者融合并构建反向重复,通过NcoI/BstEⅡ双酶切将反向重复序列插入双元表达载体pCAMBIA3301,获得RNAi载体p3301-SCMVCINIb1CPRi。……   
[关键词]:马铃薯Y病毒;烟草花叶病毒;黄瓜花叶病毒;甘蔗花叶病毒;基因组;RNA沉默;反向重复序列
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2011年