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MDS患者骨髓MSCs分子遗传学分析和CsA对MDS患者骨髓MSCs增殖凋亡影响的研究

王雁玲

  研究背景骨髓MSCs不仅具有自我更新、多向分化潜能和增殖特性等干细胞共同的特点,而且具有免疫调节功能,同时MSCs仅低水平表达人类主要组织相容性Ⅰ类分子,而不表达人类主要组织相容性Ⅱ类分子,故而免疫原性较低。因此骨髓MSCs在医学各个领域都具有研究和应用价值,目前已在多个临床科室中应用。骨髓MSCs成为干细胞研究的热点。 MDS是一组恶性克隆性疾病,遗传不稳定导致有明显的急性髓系白血病转化倾向,从探索MDS发病机制入手以研究急性白血病的发病机制,因而对MDS的研究也是现在血液病研究的一个热点。异基因造血干细胞移植是目前可以治愈MDS的唯一方法,一般认为,进展型MDS、输血依赖、无5q-的患者应尽早移植,但是移植后严重GVHD仍然是MDS患者移植后死亡的主要原因。而体外培养的BMSCs回输体内后,具有促进放化疗后的骨髓造血恢复,造血重建和减少GVHD发生的作用。 在肿瘤的发展过程中,恶性克隆和骨髓微环境的相互作用起着重要的作用,但对骨髓基质细胞的特性的研究甚少。MDS的发病机制目前还不十分清楚,可能涉及造血干/祖细胞增殖与凋亡、造血微环境、免疫过程的参与、基因甲基化等多方面。由于MSCs是造血微环境的重要组成部分,在造血调控中发挥着重要作用,对造血细胞的增殖和分化起着重要的调控作用。MDS患者MSCs的异常也可能对MDS发生、发展起着促进作用。MDS是一组异质性恶性克隆性造血干细胞疾病,对于MDS患者骨髓MSCs有无相应的克隆性基因异常改变,仍存在争议。 凋亡与细胞增殖一起维持机体的稳态,细胞凋亡过程的抑制和凋亡调节基因的紊乱,是疾病特别是肿瘤形成的另一重要机制,造血系统中因异常细胞凋亡引发各种血液病已日益引起人们关注。通过诱导肿瘤细胞的凋亡,可以达到治疗肿瘤的目的。CsA作为免疫抑制剂,在临床上广泛应用于器官移植后的抗排斥反应和治疗自身免疫性疾病,同时CsA也已被常用于MDS患者的治疗。近年来研究发现CsA可诱导HL-60和K562细胞凋亡。临床应用CsA是否对MDS患者组骨髓MSCs产生影响值得研究,但是关于CsA对MDS患者MSCs增殖和凋亡的影响作用鲜见报道。 研究目的本研究采用细胞遗传学和间期荧光原位杂交技术分析MDS患者的骨髓单个核细胞染色体的数目和结构,并研究MDS患者骨髓MSCs的生物学特性和核型,分析MDS骨髓MSCs核型是否存在与患者骨髓单个核细胞相应的克隆性基因异常改变;研究CsA对MDS患者MSCs增殖和凋亡的影响作用,从而探究MDS患者骨髓MSCs是否有异常,MDS患者骨髓MSCs在发病中是否发挥作用,也为MDS患者的自身骨髓MSCs治疗提供依据。 研究方法(1)对42例MDS患者应用细胞遗传学和/或间期荧光原位杂交技术分析MDS患者的骨髓单个核细胞。(2) MDS患者骨髓MSCs的培养及鉴定。对42例MDS患者骨髓采用贴壁筛选法分离、培养、纯化骨髓MSCs,同时采集15例营养不良性贫血患者的骨髓标本作为对照组。观察骨髓MSCs在光镜下的生长特征,诱导骨髓MSCs成为胰岛分泌细胞,对所获得的细胞进行免疫表型(CD29、CD34、CD45和CD105)的检测,确定所获细胞绝大多数为骨髓MSCs。(3)收集经细胞遗传学或/和应用荧光原位杂交技术检测证实有明确克隆性异常的17例MDS初诊患者的骨髓标本,培养为骨髓MSCs,应用间期荧光原位杂交技术术分析这些MDS患者的骨髓MSCs。(4)收集15例未经治疗的以RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ为主的MDS患者骨髓,同时采集15例营养不良性贫血患者的骨髓标本作为对照组。培养为骨髓MSCs,将MDS患者组和对照组分别分为4组,未加药组、1×103ng/mlCsA浓度组、1×104ng/mlCsA浓度组、5×104ng/mlCsA浓度组;应用MTT分析CsA对MDS患者的MSCs的增殖的影响。(5)收集15例未经治疗的以RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ为主的MDS患者骨髓,同时采集15例营养不良性贫血患者的骨髓标本作为对照组。培养为骨髓MSCs,将MDS患者组和对照组分别分为3组,未加药组、1×103ng/mlCsA浓度组、1×104ng/mlCsA浓度组,应用流式细胞仪测定、RT-PCR等技术分别分析CsA对MDS患者的MSCs的凋亡率、以及CsA对MDS患者MSCs的Caspase-3的mRNA表达和蛋白酶活性的影响。 研究结果(1) MDS患者的骨髓单个核细胞经检测证实存在明确的克隆性异常,如5q-、+8、7q-、20q-、i(17)、+15、+22等异常。(2) MDS患者的骨髓MSCs培养、鉴定:骨髓MSCs呈梭形、漩涡状生长。骨髓MSCs经成胰岛样细胞诱导后表达胰岛样细胞特征。流式细胞仪表面标志鉴定显示高表达MSCs的重要标志物CD29、CD105,不表达造血细胞表面抗原如造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45。MDS患者的骨髓MSCs胰岛样细胞诱导分化能力同对照组。RCUD、RCMD类型的MDS患者骨髓MSCs原代细胞培养时间与健康对照组原代细胞培养时间相近但稍长。RAEB-Ⅰ、RAEB-Ⅱ类型的MDS患者骨髓MSCs原代细胞培养时间较健康对照组稍短,与慢粒患者AA患者骨髓MSCs原代细胞培养时间相近但稍长。(3)对于经检测证实骨髓单个核细胞存在明确的克隆性异常的MDS患者,其骨髓MSCs未发现存在相应的克隆性异常。(4) MDS患者MSCs组的吸光度的平均值比对照组MSCs组高,吸光度值不随CsA浓度增加而改变,CsA对MDS患者组和正常对照组MSCs无促进增殖作用,CsA对MSCs的增殖无显著影响。(5)随着加入CsA浓度的逐渐增加,MDS患者MSCs的Caspase-3mRNA表达上升,其Caspase-3蛋白酶活性逐渐增强,MDS患者MSCs的凋亡率增加。CsA对正常对照组MSCs无促进凋亡作用。 研究结论(1) MDS患者的骨髓单个核细胞中确实存在克隆性的基因异常改变,如5q-、+8、7q-、20q-、i(17)、+15、+22等异常。但是检测这些患者的MSCs,未发现相应的基因异常标志。(2) MDS患者的骨髓MSCs形态、免疫表型特征和胰岛样细胞诱导分化能力同对照组。与对照组原代细胞培养时间相比,不同类型的MDS患者骨髓MSCs原代细胞培养时间长短不同。RAEB-Ⅰ和RAEB-Ⅱ类型的MDS患者MSCs细胞增殖状态活跃,可能显示有一定的恶性程度。(3) MDS患者组MSCs的增殖活性明显较对照组高。CsA对于对照组和MDS患者组的MSCs无促进增殖作用。(4) CsA对于对照组MSCs无促进凋亡作用。但CsA通过提高MDS患者MSCs的Caspase-3的mRNA表达和蛋白酶活性,促进MDS患者MSCs的凋亡。……   
[关键词]:骨髓增生异常综合征;核型异常;间期荧光原位杂交技术;骨髓MSCs;CsA;增殖;凋亡
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山西医科大学2011年