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HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBV基因表达及SOCS-3和SREBP-1c通路的影响

王艳

  研究背景 慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染引起的,已成为一个严重的全球性公共卫生问题,全世界共有20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染者。在慢性HBV感染者中,约15%~25%最终死于与HBV感染相关的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC),其中慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)、代偿期和失代偿期肝硬化患者的5年病死率分别为0%~2%、14%~20%和70%~86%。多年来,我国慢性乙肝的发病数和发病率一直高居前列,严重危害人民的健康,2006年卫生部公布的全国乙型肝炎病毒感染流行病学调查结果显示,1~59岁人群乙肝表面抗原携带率为7.18%。 非酒精性脂肪肝病(Nonaleoholie Fatty Liver Disease,NAFLD)是除外过量饮酒和其他明确损肝因素所致的,以弥漫性大泡性脂肪肝变性为特征的获得性代谢应激性肝损伤,NAFLD是一种与胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)和遗传易感性密切相关的代谢应激性肝损伤,疾病谱包括单纯性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver,NAFL),脂肪性肝炎(Non-alcoholic Steatohepatitis,NASH)及NASH相关肝硬化。流行病学调查表明,NAFLD已呈全球化流行趋势,约20~30%甚至更高的的人患有NAFLD。我国NAFLD在过去的10年里增加了近一倍。NAFLD可以直接引起肝病发生发展,甚至引起急性肝功能衰竭(Acute Liver Failure,ALF)。临床研究发现,许多CHB患者合并有NAFLD,这种现象越来越受到众多的学者的重视,综合一些大规模的流行病学调查结果,NAFLD在CHB人群中的发生率大约在11~15%之间。 研究证实,高达62%丙型肝炎患者合并有NAFLD,IR在HCV(Hepatitis C virus)感染者体内广泛存在。HCV基因型1型和4型可通过IR导致肝脂肪变性,基因型3型则能直接引起肝细胞的脂肪变性,这些代谢因素的影响,加速肝纤维化的形成以及肝癌发生的风险。那么,HBV是否也会同HCV一样导致IR?肝细胞脂肪变对肝内HBV的复制、抗原的合成和表达有无影响?HBV在脂肪肝的发生过程中起协同还是拮抗作用?目前这些问题已引起了学术界的高度关注,也是本研究的主要内容。 本研究共分为以下四部分: 第一部分HepG2.2.15细胞脂肪变性模型的建立。 第二部分HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBVDNA和蛋白表达的影响研究。 第三部分HBV对脂肪变性HepG2.2.15细胞SOCS-3及SREBP-1c通路的影响研究。 第四部分TGFβ1对HepG2.2.15细胞脂肪变性的影响研究。 第一部分HepG2.2.15细胞脂肪变性模型的建立 实验一HepG2及HepG2.2.15细胞的培养与观察 目的建立HepG2/HepG2.2.15细胞冻存、复苏和传代的条件,了解细胞增殖特性及HBV的复制和表达能力。 方法采用无菌培养方法,细胞培养液中添加G418,倒置显微镜观察细胞生长状况,台盼蓝细胞的计数及活力鉴定,荧光实时定量PCR方法检测细胞上清液中的HBV DNA,时间分辨荧光分析仪检测HBsAg和HBeAg。 结果含10% FBS培养基可维持细胞的指数生长,含70% FBS的冻存液可保证细胞复苏成活率达90%,HepG2.2.15细胞HBVDNA、HBsAg及HBeAg量随培养时间延长而稳步增长。 结论HepG2/HepG2.2.15生长快速,对培养基和冻存液血清浓度要求较高。定期向HepG2.2.15细胞培养液中添加G418可保证HepG2.2.15内HBV的稳定复制和蛋白表达。 实验二HepG2及HepG2.2.15细胞脂肪变性模型的构建 目的建立HepG2/HepG2.2.15细胞脂肪变性的实验条件。 方法选择油酸(OA)作为脂肪诱导剂,设定0.1~0.4mM浓度梯度对HepG2/HepG2.2.15细胞进行脂变诱导。细胞分为对照组、二甲基亚砜(DMSO,油酸溶剂)组和不同浓度OA组。MTT法检测细胞相对活性并制作细胞生长曲线,油红O-苏木素染色观察细胞内脂滴情况并计算脂变率。 结果生长曲线结果显示,OA浓度≤0.2mM时细胞增殖活力不受影响,OA浓度>0.2mM后随OA浓度增高细胞的增殖能力逐渐下降,0.2%DMSO不影响细胞的增殖。油红O染色结果显示,在0.2mM浓度OA作用下24h时细胞内开始出现橘红色小脂滴,随作用时间的延长脂滴逐渐增多增大,72h时形成明显脂变。HepG2.2.15细胞在24h、48h时的平均脂变率均低于HepG2细胞(P=0.028,0.022),72h时无明显差异(P=0.372)。 结论0.2mM浓度的OA作用72h可使HepG2/HepG2.2.15细胞在不影响细胞增殖能力的情况下形成明显的脂肪变性,HepG2.2.15细胞脂变程度在24h、48h时低于HepG2细胞,72h时无明显差异。 实验三HepG2及HepG2.2.15细胞脂肪变性对TG及ALT的影响 目的探讨HepG2/HepG2.2.15细胞脂肪变性对TG及ALT的影响。 方法细胞分为HepG2细胞对照组(C1组),HepG2.2.15细胞对照组(C2组),HepG2细胞脂变组(F1组),HepG2.2.15细胞脂变组(F2组),按照第一部分实验二方法对HepG2/HepG2.2.15细胞用不同浓度OA进行脂变诱导,采用反复冻融法裂解细胞,全自动生化分析仪检测细胞内的TG及细胞上清液中的ALT。 结果 1、TG:配对t检验,F1大于C1组,F2组大于C2组。独立样本t检验,F1组大于F2组,24h、48、72h均有统计学意义(P均<0.05)。 2、ALT:配对t检验,F1组大于C1组,F2组大于C2组,48、72h有统计学意义。独立样本t检验,F1组小于F2组,24h、48、72h均有统计学意义(P均<0.05)。 结论:HBV可抑制脂变细胞TG的合成和增加脂变中细胞膜损伤。 第二部分HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBVDNA和蛋白表达的影响 实验一、HepG2.2.15细胞脂肪变性对HBV DNA的影响 目的探讨肝细胞脂肪变性对细胞内HBV复制的影响。 方法细胞分为对照组(C2组)和脂变组(F2组),按照第一部分实验二建立的方法对HepG2.2.15细胞进行脂变诱导。采用荧光实时定量PCR方法检测细胞上清液中的HBVDNA。 结果对照组上清液中HBV DNA(对数值)随培养时间的延长稳定上升,呈一条直线,脂变组HBV DNA呈现曲折上升方式。配对t检验,结果显示:24h、48h、72h时F2组HBV DNA与C2组相比,无统计学意义(t=-2.93,P=0.784;t=0.065,P=0.951;t=1.551,P=0.182)。 结论脂肪变性对HepG2.2.15细胞内病毒复制能力无显著影响,但会造成HBV DNA的复制的轻微波动。 实验二、脂肪变性对HepG2.2.15细胞HBV蛋白表达的影响 目的探讨肝细胞脂肪变性对细胞内HBV标记物表达的影响。 方法细胞分为对照组(C2组)和脂变组(F2组),按照第一部分实验二建立的方法对HepG2.2.15细胞进行脂变诱导。采用时间分辨荧光分析仪检测细胞上清HBsAg、HBeAg。 结果 1、HBsAg的表达:配对t检验结果显示,F2与C2组24h相比,t=32.985,P<0.001,48h相比t=5.843,P=0.002,72h相比t=10.517,P<0.001,均有统计学意义,提示HepG2.2.15脂变组HBsAg的表达较对照组明显下降。 2、HBeAg表达:配对t检验结果显示,F2与C2组24h相比t=0.283,P=0.789,48h相比t=0.523,P=0.623,72h相比t=-0.542,P=0.611,均无统计学意义。提示HepG2.2.15脂变组与对照组之间24h、48h、72h时HBeAg表达均无明显变化。 结论HepG2.2.15细胞脂肪变性对其胞内HBV的HBsAg、HBeAg表达影响不同。可显著抑制HBsAg的合成表达,而对HBeAg无影响。提示HBsAg下降可能与脂变导致细胞膜结构有关。 第三部分HBV对细胞脂肪变性 HepG2.2.15细胞SOCS-3及SREBP-1c通路的影响研究 目的探讨HepG2/HepG2.2.15细胞脂肪变性对SOCS-3、SREBP-1c通路的影响 方法细胞分为HepG2对照组(C1组)、HepG2.2.15对照组(C2组)、HepG2脂变组(F1组)、HepG2.2.15脂变组(F2组),按照第一部分实验二建立的方法对HepG2/HepG2.2.15细胞进行脂变诱导,采用免疫组化法观察SOCS-3及SREBP-1蛋白在细胞内的表达变化,采用实时定量PCR法检测SOCS-3及SREBP-1mRNA的相对表达情况。 结果 1、免疫组化结果显示,随脂变作用时间的延长HepG2/HepG2.2.15细胞内SOCS-3染色的逐渐变淡,SREBP-1c染色的逐渐加深; 2、SOCS-3 mRNA:C2组水平远远低于C1组(P<0.001),F1组较C1明显降低,有统计学意义(P=0.003),F2组较C2组相比也出现降低,但无统计学意义(P=0.173)。细胞*脂变有交互作用(F=25.547,P<0.001); 3、SREBP-1c mRNA:C2组表达明显高于C1组(P=0.013),F1组较C1组,F2组较C2组均出现的表达上调。但F2组与C2组比较有统计学差异(P=0.002),F1组与C1组比较无统计学意义(P=1.000)。提示细胞*脂变有交互作用(F=5.04,P<0.03)。 结论 1、SOCS-3:HBV基因的存在,可以抑制SOCS-3 mRNA的表达。两组细胞脂变后SOCS-3蛋白和mRNA的表达均出现下调。HepG2细胞的下调程度高于HepG2.2.15细胞。SOCS-3 mRNA的影响随细胞不同而不同; 2、SREBP-1c:两组细胞脂变后SREBP-1c的表达均表现为上调,但HepG2.2.15细胞的上调程度高于HepG2细胞。提示脂变对HepG2/HepG2.2.15细胞SREBP-1c mRNA的影响不同。HBV基因的存在可以促进SREBP-1c mRNA的表达上调。 第四部分TGFβ1对HepG2.2.15细胞脂肪变性的影响研究 目的 1、探讨TGFβ1对脂变HepG2.2.15细胞HBV复制及蛋白表达的影响; 2、探讨HepG2/HepG2.2.15脂变过程中的TGFβ1与SOCS-3 mRNA、SREBP-1c mRNA的关系。 方法细胞分为HepG2/HepG2.2.15细胞对照组(C1/C2组)和脂变组(F1/F2组),并在这两组细胞体系内加入5ng/ml TGFβ1干预,形成TGFβ1作用组(T1/T2)和脂变+TGFβ1组(TF1/TF2),采用时间分辨荧光分析仪检测HBsAg、HBeAg,荧光实时定量PCR法检测HBV DNA、SOCS-3 mRNA及SREBP-1c mRNA。 结果 1、HBVDNA T2组与C2组比较P=0.056,TF2与F2组比较P=0.178,均无统计学意义。脂变* TGFβ1无交互作用(F=10.026,P= 0.872)。 2、HBsAg T2组低于C2组,无统计学差异(P=0.961),TF2低于F2组,有统计学差异(P<0.001)。脂变* TGFβ1有交互作用(F=15.49,P= 0.001)。 3、HBeAg T2组较C2组、TF2较F2组比较均出现降低,均有统计学差异(P=0.004,P=0.034)。脂变* TGFβ无交互作用(F=0.265,P=0.813)。 4、SOCS-3 mRNA T1组较C1组、TF1与F1组、T2组与C2组、TF2组F2组相比均发生下调(分别为P=0.050,P<0.001,P<0.001,P<0.001),TF2与TF1相比,P<0.001。脂变* TGFβ1有交互作用(F=1.872,P=0.184),细胞* TGFβ1无交互作用(F=12.628,P=0.001)。 5、SREBP-1c mRNA T1组较C1组、TF1与F1组、T2组与C2组、TF2组F2组相比均发生上调(P均≤0.001),TF2与TF1相比,P<0.001。脂变* TGFβ1、细胞* TGFβ1无交互作用(F=7.655,P=0.009;F=9.70,P=0.003)。 结论 1、TGFβ1不影响HepG2.2.15细胞中HBV复制。 2、TGFβ1可抑制HBsAg的表达,抑制能力受脂变因素的影响,脂变组的强于非脂变组。 3、TGFβ1可抑制HBeAg的表达,抑制能力不受脂变因素的影响。 4、TGFβ1可抑制SOCS-3 mRNA的表达,这种抑制受脂变因素的影响,而与病毒因素无关。 5、TGFβ1可上调SREBP-1c mRNA的表达,这种上调与脂变因素及病毒因素无关。……