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代谢工程改造酿酒酵母生产L-乳酸

赵亮亮

  作为一种重要的平台化合物,L-乳酸的需求随着石油资源的日渐枯竭而不断增加。在目前的L-乳酸合成工艺中,以生物质为原料采用微生物发酵(乳酸菌和霉菌)工艺具有广泛的应用前景。然而由于乳酸菌营养需求高和难以耐受恶劣环境胁迫、霉菌易形成菌丝团和副产物较多等缺陷,限制了L-乳酸发酵产业的快速发展。Saccharomyces cerevisiae作为单细胞生物,能利用简单的底物进行快速生长等优点而为有机酸工业所青睐。但其自身不具备合成L-乳酸的代谢能力,需要利用代谢工程手段构建具备高效积累L-乳酸能力的菌株。本研究以S. cerevisiae CEN.PK2-1C为宿主,逐步开展了代谢工程研究,主要研究成果如下: 1选取来自于牛的乳酸脱氢酶基因(LDH),构建了游离表达载体pY13TEF1-LDH,经质粒验证和LDH基因序列的测序表明载体构建成功。并将该载体转入S. cerevisiae中,构建了具备一定L-乳酸积累能力的突变株S. cerevisiae CEN.PK2-1C-LDH。研究表明,在YNB培养基中,培养36 h后可积累3.6 g/L L-乳酸,实现了L-乳酸积累量从无到有的转变; 2采用融合PCR的方法构建了LDH的整合表达片段,其中,LDH受丙酮酸脱羧酶1(PDC1)启动子的调控。然后利用LiAc转化法将纯化后的整合片段导入酿酒酵母中,基于双交换的原理,整合片段中与S. cerevisiae基因组同源的片段在PDC1基因位点发生整合,达到敲除PDC1并整合表达LDH的目的,从而构建了LDH整合表达且缺失PDC1基因的突变株CEN.PK2-1C[LDH]最佳发酵条件下,突变株CEN.PK2-1C[LDH]可积累14.7 g/L L-乳酸,而在出发菌株CENPK2-1C的发酵液中没有检测到L-乳酸。这一结果表明,外源LDH的导入使S. cerevisiae具备高效积累L-乳酸的代谢能力;与出发菌株CEN.PK2-1C相比,突变株CEN.PK2-1C[LDH]的乙醇产量由27.3 g/L降为16.2 g/L,下降了40.6 %;进一步研究发现,随着LDH的表达,出发菌株和突变株CEN.PK2-1C[LDH]的乙醇对葡萄糖的产率系数分别为0.319 g/g和0.20 g/g; 3在此基础上通过游离表达的方式,将源于Streptococcus pneumoniae的NADH氧化酶(nox)表达于突变株CEN.PK2-1C[LDH]中,构建了胞内NADH/NAD+比率显著降低的突变株CEN.PK2-1C[LDH]-nox。nox的过量表达使胞内NADH的浓度从0.48μmol/g DCW降为0.24μmol/g DCW,而NAD+的浓度则从5.94μmol/g DCW上升到8.10μmol/g DCW,最终导致胞内NADH/NAD+比率降为0.03。与CEN.PK2-1C[LDH]相比,nox的表达使突变株CEN.PK2-1C[LDH]-nox积累L-乳酸的能力提高了32.0 %,达到19.4 g/L。而乙醇浓度下降了45.7 %,仅为8.8 g/L。……   
[关键词]:酿酒酵母;代谢工程策略;L-乳酸;乳酸脱氢酶;碳代谢流
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2011年