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具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌对植物的解盐促生作用及其ACC脱氨酶基因的克隆

滕松山

  碱蓬(Suaeda salsa)是一种生长于盐碱地和海滨沙滩的耐盐性极强的盐生植物,在我国分布广泛,是当前生物改良盐渍土的首选植物品种。大量研究证明,碱蓬的耐盐能力主要源自耐盐关键基因的表达或调节,而碱蓬内生菌的多样性及其对碱蓬的生长及生理功能的影响却长期处于被忽视的地位。众所周知,生物之间的共生是一种极为普遍的生命活动和生态现象,大部分植物内生菌都是植物物种进化的结果,即内生菌通过与宿主植物的相互作用,使植物能够在特定环境下生长、繁殖。有研究表明,感染内生真菌的植物具有较高的抗逆境胁迫的能力,而一些具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性的内生细菌在促进宿主植物的生长及抗重金属胁迫中也起到了作用,该酶是通过催化乙烯的关键中间前体物质ACC转化成α-丁酮酸来降低乙烯水平,从而缓解逆境胁迫产生的乙烯对植物造成的不良影响。 为深入探讨处于高盐环境中碱蓬内生细菌的生态作用,本文从分离、筛选具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌入手,对分离到的菌株测定其生物学特性并进行生理生化及分子生物学水平的鉴定,然后通过种子萌发试验及盆栽试验对菌株的解盐促生效果作初步评价,最后对其ACC脱氨酶基因进行克隆并进行生物信息学分析。具体结果如下: 1.从山东东营健康碱蓬植株体内分离筛选到具有较高ACC脱氨酶活力的内生细菌LP11、SS12、TW1及TW2,4株菌还可不同程度地产生铁载体、吲哚乙酸、赤霉素和脱落酸,且均有溶磷作用,但无固氮能力及蛋白酶活力,唯有菌株SS12对萝卜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cucumerinum)具有拮抗作用。根据形态特征、生理生化、API鉴定系统和16S rRNA将其分别鉴定为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。 2.通过种子萌发试验及盆栽试验研究了不同NaCl浓度胁迫下菌株LP11对不同植物的解盐促生作用。结果表明,菌株LP11不仅能促进宿主碱蓬种子的萌发,还有助于非盐生植物黄瓜及油菜种子的萌发,且经LP11菌悬液处理的种子的芽长与未接菌的处理相比均有一定程度的增加; LP11还可显著促进不同盐浓度条件下黄瓜与玉米植株的生长,其根长、叶长、株高及鲜重与相应对照比较亦有一定程度的增加;除此之外,LP11能够促进黄瓜和玉米植株合成叶绿素、可溶性糖及脯氨酸,从而增强植物的抗逆能力。 3.本实验对菌株LP11的ACC脱氨酶基因进行了克隆,可为今后将ACC脱氨酶基因转化植物、从而增强植物的抗逆性奠定基础。应用CODEHOP法扩增菌株LP11 ACC脱氨酶基因的保守序列,再通过染色体步移法获得该基因已知区域5’及3’端的非保守的未知区域,最后根据拼接的序列设计引物,通过PCR扩增获得acdS基因的完整编码区。测序结果显示,该片段长996 bp,通过Blast搜索及系统发育分析表明菌株LP11的acdS基因与Pseudomonas fluorescens SBW25的acdS基因亲缘关系最近,其编码的AcdS蛋白亦与后者编码产物同源性最高。最后用SWISS-MODEL软件对该ACC脱氨酶的三维结构进行了预测展示。……   
[关键词]:碱蓬;ACC脱氨酶;内生细菌;解盐促生;基因克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东师范大学2011年