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苏云金杆菌cry7Ab8基因的克隆表达及工程菌构建

冯静静

  苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,苏云金杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白。从Bt菌株中分离克隆杀虫基因,将有效开发利用我国丰富的杀虫基因资源,缩小国内外在Bt杀虫基因基础研究领域中的差距,为工程菌和抗虫转基因植物的构建提供新的基因来源。 本研究利用改进的温度筛选法,从采自河北周边地区的208份土壤样品中分离,得到7株野生型苏云金杆菌(Bt)菌株。晶体形态的镜检观察和SDS-PAGE分析表明,大部分菌株都能表达约130kDa和60kDa的杀虫晶体蛋白。用PCR的方法确定7株野生型苏云金芽胞杆菌(Bt)菌株的基因型,其中GWS7菌株含有cry7基因。 克隆对鞘翅目害虫有毒力的Bt新菌株GWS7的cry7基因,并对该基因进行表达和杀虫活性的研究。利用全长PCR方法克隆cry7Ab8基因,将cry7Ab8基因插入到表达载体pET28b,获得重组质粒pETcry7Ab8,转化E.coli BL21(DE3),诱导后表达130kDa的蛋白。将cry7Ab8基因连接到大肠杆菌-苏云金杆菌的穿梭载体pSXY422b,获得重组穿梭质粒pScry7Ab8,电激转化到苏云金杆菌无晶体突变株HD73-(cry-),获得工程菌BioHD7Ab8,表达蛋白后进行生物活性测定。生物活性测定结果显示Cry7Ab8蛋白对马铃薯瓢虫2龄幼虫有较强的杀虫活性,LC50为548μg/mL。 设计引物得到cry7Ab8基因中编码DomainⅠ和DomainⅡ的基因,命名为Δcry7Ab8。将Δcry7Ab8基因插入到表达载体pET28b,获得重组质粒pETΔcry7Ab8,转化E.coli BL21(DE3),诱导后表达56kDa的蛋白。将Δcry7Ab8基因连接到大肠杆菌-苏云金杆菌的穿梭载体pSXY422b,获得重组穿梭质粒pSΔcry7Ab8,电激转化到苏云金杆菌无晶体突变株HD73-(cry-),获得工程菌BioHDΔ7Ab8,表达蛋白但不形成晶体结构。生物活性测定结果显示ΔCry7Ab8蛋白对马铃薯瓢虫2龄幼虫没有杀虫活性。表明Cry7Ab8中的DomainIII及C末端可能对其晶体结构的形成和杀虫活性起一定的作用。……   
[关键词]:苏云金杆菌;cry7Ab8基因;Δcry7Ab8基因;基因克隆;基因表达;杀虫活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2011年