手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析

赵丹

  病毒增效蛋白是金属蛋白酶,能够特异性降解昆虫肠粘蛋白(IIM),从而增强病毒或是Bt杀虫晶体蛋白对昆虫的感染。蜡状芽孢杆菌组发现了芽孢杆菌属的基因组中含有enhancin -like基因,它编码的肽段与病毒的增效蛋白相似性为20%~30%,研究发现苏云金杆菌BMB171中的Enhancin-like蛋白能够降解棉铃虫幼虫的肠粘蛋白从而增强cry1Ac蛋白对棉铃虫的毒性,与病毒增效蛋白的作用相似。细菌中Enhancin-like蛋白的增效作用是否具有广谱性尚不明确。 本研究从实验室保存的Bt菌株中筛选并成功克隆得到enhancin-like基因,提交GenBank登记,登录号为JF806504。该基因读码框为2202个碱基,编码733个氨基酸,预测的蛋白质的分子量为84kDa。Blastn结果发现其与病毒增效蛋白的相似性为22%~25%,与细菌增效蛋白的相似性为96~100%,并且具有保守锌结合结构域(HEIAH),属于金属蛋白酶超家族成员。 将重组表达质粒pET30a-enhancin-like转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测,enhancin-like基因在E.coli BL21(DE3)成功表达84 kDa的蛋白,再将enhancin-like基因连接到穿梭载体pSXY422b,电激转化HD73-(cry-),构建工程菌,Western blot分析表明,enhancin-like基因能在HD73-(cry-)中稳定表达。 利用亲和层析的方法得到纯化的Enhancin-like蛋白。纯化的Enhancin-like蛋白体外处理粉纹夜蛾和甜菜夜蛾围食膜,围食膜肠粘蛋白未降解。生物活性测定纯化的Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾幼虫,与单独用Cry9Ea蛋白饲喂粉纹夜蛾时,死亡率均为60%,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂粉纹夜蛾时死亡率显著提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时无杀虫活性。用Cry9Ea蛋白单独饲喂甜菜夜蛾时,死亡率为5%,Enhancin-like蛋白与Cry9Ea蛋白共同饲喂后死亡率没有变化,而Enhancin与Cry9Ea蛋白共同饲喂甜菜夜蛾时死亡率显著提高达到100%,Enhancin-like蛋白单独饲喂时则无杀虫活性。生测结果表明Enhancin-like蛋白没有增加Cry9Ea蛋白的毒性。……   
[关键词]:苏云金杆菌;Enhancin-like蛋白;Cry9Ea蛋白;生物活性测定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2011年