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应用实时荧光PCR和PCR-DHPLC技术检测饲料中禽、鱼源性成分的研究

庞杰

  饲料安全和环境生物安全是关系我国可持续发展的重大问题,是制约我国经济发展的重要因素。饲料污染造成的食源性疾病和环境危害,是我国饲料安全和环境生物安全中最突出的问题。因此,加强饲料中动物源性成分准确、高通量检测技术的研究,建立高效、持久、精准、高通量的饲料中动物源性成分的检测技术,对保证我国食品安全,提高我国饲料、食品国际竞争力都具有重要意义。 研究采用试剂盒和十六烷基三甲基溴化铵提取法(CTAB)提取动物基因组DNA,经电泳检测和浓度、纯度检测,确立提取动物基因组DNA采用CTAB法。 选择线粒体DNA (mtDNA)的保守区设计合成实时荧光定量PCR检测引物、探针和PCR-DHPLC检测引物,经序列BLAST分析、PCR检测条件和DHPLC分析条件的优化,初步确立饲料中禽(鸡、鸭、鹅、鹌鹑)、鱼源性成分的实时荧光定量PCR检测体系和检测饲料中禽(鸡、鹅)源性成分的PCR-DHPLC检测体系,为保障动物源性饲料与畜产品食用安全提供技术支持。研究结果显示: (1)实时荧光定量PCR检测体系可有效扩增鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鱼模板DNA,扩增具有典型的“S”型曲线特征,指数扩增期明显,与其它动物成分无交叉反应;PCR-DHPLC检测体系可特异性扩增鸡、鹅基因组DNA,对其他畜禽及水产品动物DNA均无扩增。 (2)实时荧光定量PCR检测体系可检测出的饲料中的鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鱼源性成分的灵敏度分别为0.1%、1%、0.05%、0.1%和0.1%;PCR-DHPLC检测体系可检测出的饲料中的鸡、鹅源性成分的灵敏度分别为0.1%和0.01%。除对鸭源性成分的检出限为1%,其余灵敏度检测均达到了国际食品法典委员会和国际兽医局提出的0.1%的检测限要求。 (3)实时荧光PCR批内试验的3个平行样扩增曲线在对数扩增期基本重合,批间9次重复Ct值变异系数均小于2%,从PCR反应液配制到检测完成仅需1.5h,检测快速;同一样品经PCR-DHPLC检测体系5次检测结果均出现相同的出峰时间,峰型一致。 (4)通过对12份饲料样品检测,实时荧光定量PCR检测体系共检出鸡源性成分样品8份,鸭源性成分样品3份,鹅源性成分样品2份,未检出鹌鹑源性成分和鱼源性成分饲料样品;PCR-DHPLC检测体系共检出鸡源性产品8份,鹅源性产品2份;二者的检测结果与实地调查结果符合率均达100%。 研究结果表明,实时荧光PCR方法和PCR-DHPLC方法均具有检测特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,二者均可用于动物源性饲料与畜产品食用安全检测。……   
[关键词]:动物源性成分;饲料;实时荧光PCR;变性高效液相色谱
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:沈阳农业大学2010年