手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

透明质酸包封的非病毒基因微载体的研究

徐志学

  采用超分子组装技术制备的非病毒基因传递体系,由于具有合适的纳米尺寸、可控的结构及良好的生物相容性,显示出巨大的发展潜力及应用前景。制备具有良好生物稳定性、低细胞毒性并高效转染的非病毒基因微载体是亟需解决的关键的科学问题之一 聚乙烯亚胺(PEI)由于具有“质子海绵效应”,是常用的一类非病毒基因载体。但PEI/DNA组装体在体内易聚集,从而被网状内皮系统清除出体内,限制了治疗基因到达靶向细胞、组织的数量。透明质酸(HA)是一种带有负电荷的天然多糖,是细胞外基质的主要成分,具有优异的生物相容性。本论文以透明质酸或巯基化透明质酸为被膜材料,采用超分子组装技术制备了三元缔合的基因超分子组装体,初步探讨了超分子组装体的结构与基因转染效率的内在联系。 我们首先将透明质酸加入到PEI/DNA组装体溶液中,在静电驱动力作用下,形成PEI/DNA/HA超分子组装体。HA的加入量对组装体的性质有很大的影响。随着HA加入量的增大,PEI/DNA/HA组装体的表面电位逐渐降低。原子力显微镜及透射电镜图片显示:PEI/DNA/HA组装体呈现规整的球形结构,尺寸为250nm左右。凝胶电泳及荧光光谱测定结果表明:HA的加入使得荧光强度略有增强,组装体结合松散,但并没有观察到自由的DNA条带,说明HA的加入并没有导致基因超分子组装体的解离。体外细胞培养结果显示:与PEI/DNA组装体相比,PEI/DNA/HA组装体的细胞毒性显著降低。不同细胞对HA包封基因微载体的内吞及转染效率显示出差异。由于细胞膜表面为负电,随着HA的加入,带负电荷的HA包封基因微载体不易被HEK293T细胞内吞,转染效率略有降低。与此相对,肝肿瘤细胞HepG2细胞对PEI/DNA/HA组装体的内吞率较PEI/DNA组装体有了明显提高,转染效率也随之大幅度增加。我们认为由于肿瘤细胞表面存在大量HA的受体CD44,可通过HA的受体介导内吞提高基因超分子组装体进入肿瘤细胞的内吞率及转染肿瘤细胞的效率。 人体内存在着大量的负电荷的蛋白质,可能导致基因超分子组装体的解离。制备壳层原位交联的基因超分子组装体,是实现细胞外稳定传递以及细胞内有效解离释放的一种行之有效的方法。我们进一步合成了巯基化透明质酸(HA-SH)并以此为被膜制备了PEI/DNA/HA-SH组装体,通过巯基在氧气中的原位交联,制备了壳层二硫键原位交联的基因超分子组装体。动态光散射结果及透射电镜图像表明;随着壳层的交联,基因微载体为粒径在200nnm左右的球状结构。与PEI/DNA/HA组装体相比,壳层的原位交联使微载体对DNA的缔合更紧密,同时在生理盐溶液中的稳定性有所提高。以聚丙烯酸(PAA)为模型聚阴离子,凝胶电泳测定结果表明:当PAA浓度为2mmol/L时,PEI/DNA/HA组装体完全解离,释放出自由的DNA;而随着氧气中交联时间的延长,壳层原位交联的组装体的聚阴离子稳定性显著提高。壳层原位交联组装体还显示出谷胱甘肽响应特性,在谷胱甘肽浓度达到3mmol/L时,由于二硫键的断裂导致交联壳层的消失,在负电荷的PAA的作用下,组装体解离释放出自由DN。HEK293T细胞培养结果显示:巯基化透明质酸包封的基因微载体的细胞毒性明显降低。由于HEK293T细胞膜表面带负电,壳层原位交联的组装体的内吞率较PEI/DNA组装体低,转染效率降低。但采用GSH-OEt孵育处理过细胞后,组装体转染效率大为增加,能够达到接近PEI/DNA的转染水平,显示出很好的谷胱甘肽响应特性。本研究为采用超分子组装技术制备新型的非病毒基因传递体系提供了切实可行的途径。……   
[关键词]:超分子组装;非病毒基因载体;壳层原位交联;透明质酸;聚乙烯亚胺
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2011年