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球孢白僵菌超氧化物岐化酶(SODs)的基因克隆、鉴定及功能分析

谢雪钦

  作为经典的丝孢类昆虫病原真菌,球孢白僵菌因其易于生产和环境友好等优点而在农林害虫防治中广泛青睐。然而以具有完整细胞结构的侵染体为主要活性成分而开发的生防菌剂,其杀虫效果往往受到田间各种环境因素的制约,氧化胁迫就是其所遭遇的重要胁迫因素之一。杀虫真菌所遭遇的活性氧自由基(ROS)胁迫来自体外和体内两个方面,一是夏季高温、阳光中紫外辐射、化学农用等不利环境因子能引发细胞内ROS大量累积;二是作为病原真菌,其在正常条件下侵入宿主体内后会遭遇到宿主昆虫出于免疫保护而形成的高ROS细胞环境。因此,探索生防真菌对氧化胁迫的内在保护机制并在此基础上进行菌种改良,为提高菌剂抗逆性及毒力提供了新的生物技术途径。作为细胞抗氧化酶系的主要成员,超氧化物歧化酶SOD是细胞抵抗ROS胁迫的第一道屏障。然而,目前关于杀虫真菌SOD基因及其功能的研究报道几近空白,十分缺乏有关这类真菌抗氧化生物学的科学认识。为此,本论文试从昆虫病原真菌抗氧化胁迫的角度出发,以SOD基因家族为切入点,全面解析球孢白僵菌SOD基因的多样性及其功能,并尝试探索用SOD改良菌株毒力及抗逆性的可行性。主要研究内容及成果分述如下: 球孢白僵菌Cu/Zn-SOD基因克隆及其免分子伴侣的活性表达首次从球孢白僵菌Bb2860菌株中克隆到一种新的以Cu/Zn离子为辅基的SOD基因(BbSod1),并在无SOD特异性分子伴侣CCS的原核表达体系中通过融合表达及定点突变实现其高活性表达。BbSod1编码区长465 bp,编码154个氨基酸,其编码的氨基酸序列与已知的57种真菌Cu/Zn-SOD蛋白的同源性为49-96%。BbSod1原态酶、C端两个脯氨酸定点突变(P143S及P145L)酶(BbSod1-Mut)以及融合表达分子伴侣Lys7的融合酶(BbSod1-Lys7),均在大肠杆菌中很好地表达为可溶性重组蛋白。BbSod1-Mut转化株细胞内表达的可溶性蛋白粗提液,其SOD活性远高于BbSod1-Lys7表达的同一种酶,而BbSod1原态酶的表达则未表现出实质的活性。工程菌株在37℃培养5 h后,添加2.5 mM Cu2+、0.5 mMZn2+以及0.5 mM IPTG后在20℃下诱导过夜即可获得最高酶活。这些结果证明,通过C末端两个脯氨酸残基的定点突变能实现真菌Cu/Zn-SOD在无分子伴侣的大肠杆菌中高活性表达,为生产应用真菌Cu/Zn-SOD开辟了新的途径。 球孢白僵菌胞质Mn-SOD基因的克隆、鉴定及其对宿主菌毒力和抗逆性的影响从球孢白僵菌Bb2860菌株中克隆到一种新的Mn-SOD基因(BbSod2),编码209个氨基酸,其氨基酸序列与74种已知的真菌Mn-SOD蛋白序列的同源性不超过71%。BbSod2具有Mn-SOD基因家族的所有保守性氨基酸残基,但其N端缺乏引导成熟蛋白定位于线粒体的前导肽序列。添加Mn2+能显著提升BbSod2纯酶的活性,而Cu2+、Zn2+和Fe3+则对该酶活性表现抑制作用。在缺乏BbSod2的球孢白僵菌Bb289菌株中超表达该基因,随机挑选的五个转化子的SOD总活性提高4-10倍。与野生株相比,SOD活性最高(1157.9±74.7 U/mg蛋白)的超表达转化株的菌落和分生孢子对氧自由基产生剂甲萘醌的耐受力分别提高93%(EC50:2.41±0.03 vs 1.25±0.01 mM)和61%(EC50:0.89±0.06vs 0.55±0.07 mM),且其分生孢子对UV-B辐射的耐受力亦提高23%(LD50:0.49±0.02vs 0.39±0.01 J/cm2)。另外,该工程菌株对斜纹夜蛾一龄幼虫的毒力增强26%[LT50:4.5(4.2-4.8)vs 5.7(5.2-6.4)天]。结果表明,球孢白僵菌的胞质Mn-SOD (BbSod2)能显著提高该菌的毒力及抗逆性,显示通过超表达抗氧化酶有可能改善真菌制剂的田间稳定性及毒力。 球孢白僵菌线粒体Mn-SOD基因的克隆及其亚细胞定位通过序列比对及简并引物扩增,从球孢白僵菌Bb2860菌株中克隆到一种新的Mn-SOD基因(BbSod3)。该基因全长693 bp,编码230个氨基酸,其对应的DNA序列长879bp,其编码蛋白的分子量预测为24.7 kDa,等电点约为7.6。BbSod3与已知75种真菌Mn-SOD的同源性为36-93%,拥有Mn-SOD家族的所有保守性氨基酸。在线软件件MitoProtⅡ预测分析显示,该蛋白定位于线粒体的概率达0.9987,其N端前35个氨基酸是引导其定位的信号肽。在此基础上,通过上述预测信号肽序列(Sig)与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的融合表达(Sig-eGFP)以及线粒体特异性探针MitoTracker Red的定位标记分析,确认BbSod3是在其N端的35个氨基酸残基的引导下定位于该菌线粒体内。 球孢白僵菌胞质与线粒体Mn-SOD基因的互作酶型分析及Western杂交证实球孢白僵菌Bb2860菌株中菌丝体的SOD活性主要来自两种Mn-SOD,故采用RNA干扰技术研究BbSod2和BbSod3基因的互作。分别构建靶向于BbSod2、BbSod3和同时靶向二者的表达发夹状RNA干扰结构的干扰载体,转入宿主菌株后,发现三类干扰载体均能有效下调各基因转录量达70%以上。各干扰反应取总SOD活性最低的代表性干扰子C2(针对BbSod2)、M1(针对BbSod3)和CM3(针对二者)与野生株进行平行的菌株抗逆性分析。结果表明,干扰子的菌落(F3,32=3,659,P<0.01)和分生孢子(F3,11=132,P<0.01)对甲萘醌的耐受力较野生株显著下降。对BbSod2和BbSod3基因的干扰使C1、M1和CM3分生孢子对甲萘醌的耐受力分别下降38%、52%和66%。另外,三个干扰子对UV-A辐射的敏感性(LD50:15.83±0.66、17.97±0.41、16.96±0.40 J/cm2)亦比野生株(LD50:21.81±0.60 J/cm2)分别提高32%、18%和22%。然而,上述三个干扰反应均不显著影响菌株对高温、高渗透压和UV-B辐射等胁迫的耐受力。 综上所述,本研究的成果及创新点主要在于,一是系统研究了了球孢白僵菌中的SOD基因家族,克隆获得了三种新的SOD基因,为阐释SOD酶在生防真菌中的功能奠定了基础。二是通过基因融合及定点突变技术成功实现了真菌Cu/Zn-SOD在无专一性分子伴侣CCS的原核表达系统中的高活性表达。三是应用超表达和RNA干扰技术,揭示了胞质Mn-SOD在球孢白僵菌抗氧化、耐紫外辐射胁迫及提高菌株毒力方面的重要功能,以及胞质与线粒体Mn-SOD的基因互作。这些结果将有助于推进丝孢类杀虫真菌抗氧化生物学的研究,展示了从抗氧化保护酶的新视角改良生防真菌的新思路,并为其它真核Cu/Zn-SOD基因的开发和应用提供新的无分子伴侣技术途径。……