手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

微流控芯片动态胞吞和高通量单细胞分析的研究

徐春秀

  细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单元,人们要了解生物体生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,考察细胞的结构和功能,探索细胞的生命活动。细胞的胞吞是将细胞外基质、病毒、微组织或纳米粒子运送到细胞内部的一个重要生理过程。目前研究纳米粒子的胞吞主要采用的是静态法,即将纳米粒子和细胞在静止的状态下共培养。而人体的实际情况有所不同,被人体摄入的纳米粒子处在血液循环当中,用传统的细胞培养方法无法模拟纳米粒子在血液循环中的环境。 单细胞分析对生物、医学及重大疾病早期诊断、药物筛选等领域的具有重要意义。然而,细胞内的物质含量极低,给单细胞分析构成了严重的挑战。迄今为止,绝大多数芯片电泳单细胞分析的方法分析通量都较低,因此大大限制了其在实际分析中的应用。 微流控芯片的微通道尺寸和细胞的大小十分匹配,使得微流控芯片尤其适合用于细胞的引入、操纵、溶膜、分离及检测。因此,芯片系统用于胞吞和单细胞分析引起了极大的兴趣。但是,大部分体细胞倾向于吸附在细胞容器如玻璃或塑料表面,因此,高通量分析单细胞的难度很大。 本文用微流控芯片在体外模拟人体血液流动状态下细胞胞吞二氧化硅纳米粒子的方法和特性。通过调节储液池的液面差,细胞从微通道入口流入并在通道内沉积贴壁生长。将含有贴壁细胞的微流控芯片放入37℃and 5% C02的培养箱中,使细胞培养液连续流过贴壁细胞,培养24小时后,在流动的培养液中加入作为荧光标记物的500 nm粒径掺杂异硫氰酸荧光素(FITC)的二氧化硅微球(MSN),继续培养6 h后,用荧光显微镜测定细胞胞吞二氧化硅纳米粒子后的荧光强度,考察了不同流速下细胞对二氧化硅微球摄入量的影响。与传统的静态实验方法对比,本方法首次模拟了人体中血液流动对药物吸收的影响。在动态条件下,细胞对二氧化硅微球的吞噬量明显下降,当流速从0.022 mm/s增加至0.74mm/s时,吞噬量从静态测得值的74.7%下降至7.1%。 本文建立了高通量的单细胞分析芯片系统,该芯片系统集成了单细胞连续引入、快速动态溶膜、芯片电泳及激光诱导荧光(LIF)检测等功能于一体。设计了带两支鞘流的十字芯片。通过调节储液池的液面,被标记的细胞在液面差的作用下被鞘流水力聚焦排成一条直线并有序地通过十字交叉口。在分离通道方向加上一个电场,排列好的细胞拐进分离通道并在分离通道入口处被加在鞘流缓冲液中的Triton X-100快速溶膜(溶膜时间少于33 ms)。该方法最快的单细胞进样速度可达到150 cells/min。样品通道两边引入鞘流液能显著减少进入分离通道的PBS溶液并降低在电泳分离中由此产生的热效应。该方法用于测定人血红细胞中的谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)组分,能达到38 cells/min的分析通量。该方法简单易行且分析通量高,能快速分析大量的细胞从而给出统计结果。 本文还建立了一种基于3D聚焦连续快速分析HepG2贴壁细胞中活性氧(ROS)和还原型谷胱甘肽(GSH)的芯片电泳方法,设计了带有三条鞘流通道的十字芯片,在样品通道左右和下方各引入一条鞘流通道,样品流底部的鞘流有效地防止了细胞的沉降贴壁。标记的细胞在鞘流的3D聚焦下逐个顺利地流经过十字交叉口,在分离通道上施加电场时,排列好的细胞依次拐入分离通道并在入口处被加在鞘流中的SDS快速溶膜(<400 ms),最大的单细胞引入速度可达151 cells/min。在系统中引入鞘流通道不仅保证了高通量单细胞进样还避免进样过程中由于细胞的贴壁效应所引起的样品通道堵塞。该芯片系统用于分析单个HepG2细胞中的活性氧和谷胱甘肽,结果满意。……   
[关键词]:胞吞;微流控芯片;纳米粒子;二氧化硅微球;单细胞分析;芯片电泳;鞘流;高通量;3D鞘流聚焦
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2011年