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温度敏感性PNIPAAm-g-PDMS智能表面的制备、性能研究及在细胞培养中的应用

马丹

  微型全分析系统(μTAS,又称芯片实验室)的最终目标,是把化学和生化分析过程中的采样、预处理、分离、检测等各个操作单元集成于自动化、便携式的微型智能分析仪器之中。作为μTAS核心的微流控芯片在过去的十年中得到了迅猛的发展。如今“芯片实验室”的概念不光在在分析化学领域为人们所普遍接受和应用,而且正在大踏步地向生命科学和仿生学研究的领域进军。μTAS的发展和成功在很大程度上取决于新颖微流控芯片的研制,其中,发展新型材料以满足芯片功能需求是微流控芯片研究中极为重要的一个方面。 聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)是制备微流控芯片的最常用材料之一。它具有优良的生物兼容性和透气性,近几年中被广泛地应用于制作细胞分析和细胞生物学研究用的微流控芯片。但PDMS表面高度疏水,不具备响应环境刺激而改变其表面性质的功能。本文旨在将具有温度敏感特性的高聚物聚N-异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide), PNIPAAm)通过简单易行的方法接枝到PDMS表面,制备温度敏感性经PNIPAAm接枝的PDMS (PNIPAAm-grafted-PDMS, PNIPAAm-g-PDMS)智能表面,研究它的分析性能,探索建立基于PNIPAAm-g-PDMS智能表面的、由温度操控的细胞培养、收获和转移等微流控单元操作技术。 全文共分四章: 第一章,评述了PNIPAAm温敏智能表面的制备及其在细胞培养中的应用的研究进展。制备PNIPAAm温敏智能表面的表面接枝聚合技术主要可分为四类:溶液自由基接枝聚合、电子束及高能射线引发接枝聚合、等离子体引发接枝聚合和紫外光引发接枝聚合。而PNIPAAm温敏智能表面在细胞培养中的应用主要包括三类:温控收获、图案化异种细胞共培养和组织工程。同时介绍了PNIPAAm-g-PDMS智能表面的研究现状。 第二章,研究建立了以浸渍方式预先将光敏引发剂二苯甲酮吸附于PDMS基片表面,再通过的紫外光引发聚合反应制备PNIPAAm接枝表面的方法,详细考察了所制备的PNIPAAm-g-PDMS温敏智能表面的分析性能。实验发现,PDMS表面的PNIPAAm接枝率与PDMS基片的厚度有关,基片越厚,PNIPAAm的接枝率越低。通过研究基片厚度影响PNIPAAm接枝率的机理,提出“基片厚度通过影响引发剂二苯甲酮在其表面的浓度而对接枝率产生影响”的见解,以及提高接枝率的措施。对于厚度超过1 mm PDMS,可以通过延长二苯甲酮处理时间或者用氯仿萃取PDMS基片除去游离固化剂残余后再接枝的方法提高PNIPAAm的接枝率。所制备的PNIPAAm-g-PDMS智能表面的亲疏水性具有显著的温度敏感性,当温度从22℃上升32℃,水的静态接触角从38°上升到91°,接触角之变化量大于已报道的以硅、金等为基底的所有PNIPAAm温敏表面。PNIPAAm-g-PDMS微通道的在20℃时几乎无电渗流,当温度上升到50℃,电渗迁移率增大到5×10-4 cm2/V·s。PNIPAAm-g-PDMS智能表面在40℃时对抗癌药阿霉素(Doxorubicin, DX)有较强的吸附能力,而在5℃时能够快速释放40℃时所吸附的大部分(70%左右)DX。在37℃的培养温度下,成骨细胞能够在PNIPAAm-g-PDMS表面贴附并增殖,而在室温下,所增殖的细胞无需胰酶处理可自动脱附。 第三章,以非洲绿猴肾成纤维细胞COS7为模型,研究了PNIPAAm-g-PDMS温敏智能表面培养细胞的性能;考察了人体间充质干细胞(hMSCs)在PNIPAAm-g-PDMS表面的多向分化行为。研究表明,PNIPAAm-g-PDMS智能表面通过温度调控的细胞贴附、增殖、脱附的性能可以通过包被明胶和调整PNIPAAm接枝率得以优化。所培养的COS7细胞以传统胰酶消化方式收获,其存活率为80.6%,而以温控脱附方式收获,存活率为89.1%,两者具有显著性差异(P=0.016)。对于高度敏感的hMSCs,这种优势更为明显:用传统方式培养并收获,细胞存活率为75.7%,而在PNIPAAm-g-PDMS表面培养并用温控脱附、低浓度的胰酶消化分散的方式收获,存活率为97.2%。同时,实验表明PNIPAAm-g-PDMS智能表面培养和收获hMSCs细胞,对它们分化成脂肪、成骨、神经元细胞的潜能并无不良影响。 第四章,研究了在PNIPAAm-g-PDMS微通道内细胞的在线培养、收获和传代。以PDMS芯片为模型,从通道构型、接种/换液方式、储液池封闭方式等方面优化了微通道内细胞培养的条件。在优化条件下,可实现PNIPAAm-g-PDMS微通道内细胞的长期培养,培养3天后细胞贴壁面积约占50%-60%。通过的简单温度和液流控制,细胞可以自动脱附而无需胰酶消化,并且脱附的细胞可以在线转移到下游芯片内再培养,初步实现了PDMS微流控芯片上的细胞在线培养、收获、转移和传代培养的单元操作。 本论文的主要创新点: 1.发现了以二苯甲酮诱导紫外光聚合反应法在PDMS表面接枝温敏高聚物PNIPAAm时,PDMS基片厚度会显著影响PNIPAAm接枝率的现象。通过机理研究,提出了“基片厚度通过影响引发剂二苯甲酮在其表面的浓度而对接枝率产生影响”的见解,在此基础上,建立了针对不同厚度PDMS基片的、二苯甲酮诱导紫外光聚合反应为基础的PNIPAAm表面接枝方法。 2.建立了在PNIPAAm-g-PDMS智能表面进行基于温度调控的细胞培养和无胰酶收获的方法,并证实了其相较于传统胰酶消化收获法的优越性;在此基础上,建立了以PNIPAAm-g-PDMS温敏智能微流控通道为基础的、细胞在线培养、收获、转移和传代培养的微流控操作单元。 3.证实了在PNIPAAm-g-PDMS温敏智能表面进行干细胞的培养无碍于干细胞的多向分化潜能。……   
[关键词]:聚二甲基硅氧烷;聚N-异丙基丙烯酰胺;温敏智能表面;细胞培养;微流控芯片
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2010年
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