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水稻β-1,3葡聚糖苷酶基因Osg1的功能研究

万凌琳

  p-1,3-葡聚糖苷酶(glucan endo-1,3-β-glucosidases, E.C.3.2.1.39)催化水解p-1,3-葡聚糖(p-1,3键连接的葡聚糖多聚体)。p-1,3-葡聚糖是许多病原真菌细胞壁的主要结构成分,p-1,3-葡聚糖苷酶可直接攻击暴露在真菌菌丝表面的p-1,3-葡聚糖。因此植物中的p-1,3-葡聚糖苷酶是一类重要的病程相关(Pathogenesis Related, PR)蛋白,属于PR-2家族,可在病理或相关条件下诱导产生。同时,p-1,3-葡聚糖苷酶也参与了植物中很多生理发育过程。例如,细胞延长、细胞分裂、果实成熟(细胞壁的降解导致果实软化)、授精、花粉萌发及花粉管的延伸、芽的休眠、小孢子发生(四分体时期释放小孢子)、胚胎发生、种子萌发、花的构型等等。 水稻(Oryza sativa L.)中已经克隆了十几个β-1,3-葡聚糖酶基因,这些基因活性差异较大,表达调控的方式也不同。本研究利用生物信息分析方法与软件,对水稻的一个p-1,3-葡聚糖酶基因Osg1进行了结构及进化关系的系统分析。进化树分析表明Osgl属于单子叶植物p-1,3-葡聚糖苷酶亚家族A,该家族的成员主要和植物防御反应相关。通过在线软件PLACE分析了Osgl的启动子序列,发现了一些与花粉特异表达相关的顺式作用元件。如GTGANTG10基序是在烟草成熟花粉基因g10启动子中发现的一个 GTGA基序”,在Osgl的启动子区域有7个重复。POLLEN1LELAT52是花粉表达所必须的一个结构域,在Osgl的启动子区域有4个重复。在Osgl的启动子区域还发现了一个QELEMENTZMZM13结构域,该结构域是玉米花粉特异表达基因ZM13启动子中一个‘ Q(quantitative)-element 。另外还发现了一些与生长发育及防御应答相关的功能元件。这些结构域预示着Osgl可能参与了水稻的花粉发育。 随后,我们对水稻Osgl基因进行了详细的功能分析。Osgl基因广泛表达于水稻各个器官,在叶片及小花中表达量最高。为了进一步检测Osgl基因的表达部位,我们构建了Osgl基因的启动子驱动GUS报告基因的转化载体,并转入水稻品种H1493。结果表明,Osgl基因在根、叶鞘、叶片和小花中都有不同程度的表达,在小花中的表达呈现特异的时间性和空间性,主要在减数分裂末期和小孢子时期花药的绒毡层细胞中表达。 为阐明Osgl基因在水稻生长与发育中的功能,本研究构建了强启动子玉米泛素启动子1(Ubi1)控制下的Osg1基因的RNAi载体,并对水稻品种H1493进行了遗传转化。我们的结果表明Osgl基因的抑制可导致转基因水稻表现出多种发育上的缺陷,如生长延迟、植株矮小、败育等,说明Osgl在植物的生长发育方面起着至关重要的作用。 Osgl基因RNAi抑制植株(Osg1-RI植株)表现为雄性不育。我们对其花药发育过程的分析结果表明,Osg1-RI植株的花粉母细胞在四分体时期之前表现正常。然而,从四分体时期到小孢子早期这一过程中,Osg1-RI植株花粉中包裹四分体的胼胝质壁的降解被延迟了,导致小孢子无法及时释放到花粉囊腔中,使其进一步的发育受到阻碍,最终导致花粉细胞的败育。这些结果提供了直接的证据表明Osgl基因对花粉发育中的胼胝质的及时降解是必需的。 Osg1--RI植株还对褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)表现出一定的抗性。郝培应等(2008)在研究水稻和褐飞虱的互作中,检测了一些β-1,3-葡聚糖苷酶基因在褐飞虱取食水稻后的表达,发现Osgl在褐飞虱取食后的感性植株中上调,有利于筛板上胼胝质降解,为褐飞虱顺利取食创造了条件。但是在两个中抗品种R135和YHY15中,无论是对照还是处理材料均检测不到Osgl的表达。杜波等(2009)的研究中也有类似结果。他们推测这类基因在抗性品种中没有表达或有限上调,可能是水稻对褐飞虱表现抗性的主要原因所在。在本研究中,Osgl在褐飞虱取食后的感性植株H1493叶鞘中表达上调,而在Osg1--RI植株的叶鞘中无论褐飞虱取食与否都检测不到Osgl的表达。推测该转基因植株可能对褐飞虱具有一定的抗性。进一步通过EPG检测了褐飞虱在H1493及Osg1-RI植株上的取食行为。发现褐飞虱在Osg1-RI植株上的非刺探时间、韧皮部的穿刺次数及花费的时间远远大于感性植株H1493,而在韧皮部的取食时间上,感性植株H1493的总取食时间大大高于在Osg1-RIO植株中的时间,表明褐飞虱在Osg1-RI植株的韧皮部取食受到抑制,Osg1-RI植株对褐飞虱表现出一定的抗性。……   
[关键词]:水稻(Oryza sativa L.);褐飞虱(Nilaparvata lugens St(a|°)l);β-1;3-葡聚糖苷酶;RNAi抑制;胼胝质
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:武汉大学2010年