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重组胆固醇氧化酶表达的发酵优化

李闯

  胆固醇氧化酶是一种重要的检测用酶,除广泛应用于医疗检测外,在食品开发、医疗保健、生物农药等方面也有应用潜力。鉴于微生物来源的胆固醇氧化酶表达量小且需要胆固醇诱导的问题,本实验室成功构建了一株可胞内表达胆固醇氧化酶的基因工程菌,但是胆固醇氧化酶主要以包涵体的形式存在,活性胆固醇氧化酶表达量低。本文采取调整诱导剂,优化发酵工艺等手段提高活性胆固醇氧化酶产率,建立一系列胆固醇氧化酶高效表达技术,有助于实现胆固醇氧化酶高效低成本制备。 本文以一株胞内表达胆固醇氧化酶的工程菌E. coli BL21(DE3)-PET28a-COD为生产菌株,以减少包涵体形成,提高活性胆固醇氧化酶产率为目标,采用外因优化与内因优化相结合的策略对胆固醇氧化酶发酵过程进行优化。 1.采用乳糖诱导胆固醇氧化酶表达,提高了胆固醇氧化酶可溶表达的比例,并优化了乳糖诱导胆固醇氧化酶表达的条件。采用乳糖诱导胆固醇氧化酶表达,酶活分别为0.76U/mL,0.45U/mg;是IPTG诱导时的4.0和2.4倍,显著提高了活性胆固醇氧化酶的表达水平。在优化后的诱导条件下诱导胆固醇氧化酶表达,酶活达到5.8U/mL,为初始条件的7.6倍。 2.调节诱导阶段温度和pH提高活性胆固醇氧化酶产率,建立双程培养策略。研究了菌体生长和诱导阶段的最佳温度和最适pH,结果表明,菌体生长阶段最佳条件:温度37℃,pH7.5;诱导阶段最适条件:温度30℃,pH6.5。采用双程培养策略培养工程菌,胆固醇氧化酶酶活最终达到16.9U/mL,生产强度为1.30U/(mL·h),分别提高了191%,347%;重组酶表达量占菌体总蛋白的32%,但可溶部分占胆固醇氧化酶表达量的68%,显著提高胆固醇氧化酶的可溶表达水平。 3.7L发酵罐中研究了工程菌的培养策略,进一步提高活性胆固醇氧化酶产率。比较了四种补糖策略,确定采用葡萄糖补料培养菌体至对数生长后期,恒速流加乳糖诱导液诱导重组酶表达的方法获得最大酶活20.5U/mL,提高了21%。制定pH-stat流加甘油乳糖混合诱导液诱导工程菌表达胆固醇氧化酶的策略,产酶量达到25.8U/mL,提高了26%。……   
[关键词]:胆固醇氧化酶;重组大肠杆菌;乳糖诱导发酵;双程培养策略;恒pH-stat;可溶表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2010年