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大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh克隆、高效表达及酶学性质研究

李倩

  苹果酸脱氢酶(MDH)是三羧酸循环中的一个关键酶,在生物体内普遍存在,MDH以NADH或NAD+为辅因子,催化苹果酸盐与草酰乙酸盐的相互转化。 本课题以大肠杆菌基因组为模板,分子克隆了939 bp的mdh基因,并与表达载体pET-28a (+)连接,转化大肠杆菌BL21,得到重组菌pET-28a-mdh/BL21。IPTG诱导表达重组菌,利用表达载体pET-28a (+)上的6His·Tag标记选用Ni2+柱纯化具有酶活性的MDH,表达后的粗酶液比酶活是43 U/mg,纯化后的比酶活是112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0-6.0的酸性范围内稳定,反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Ni2+、CO2+、Fe3+对酶稍有激活作用。Cu2+、Zn2+对酶有明显的抑制作用。Hg2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L, Vmax为0.47μmol/L.min。 本实验还将苹果酸脱氢酶基因连接到分泌表达载体pET-22b(+)上,再将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3),实现了苹果酸脱氢酶的胞外表达,采用细胞裂解缓冲液一步提取法快速地在大肠杆菌的周质中获得了目的蛋白,并测得该蛋白比酶活为48.2 U/mg。 为了提高MDH的热稳定性,本实验以重组质粒pET-28a-mdh为模板,采用基因定点突变技术在苹果酸脱氢酶基因中引入三个点突变(L225K、D45E、Q229E)。将突变基因与表达载体pET-28a(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达重组菌,利用表达载体pET-28a(+)上的His6·Tag标记选用Ni2+柱纯化苹果酸脱氢酶,在不同的温度(35℃、45℃、55℃、65℃)下保温一小时,测定不同温度下的比酶活,以未经点突变的苹果酸脱氢酶为对照,发现在Q229E处对苹果酸脱氢酶基因进行定点突变后的MDH热稳定性较好。45℃保温一小时后的相对酶活仍有73%,65℃相对酶活为44%。而在L225K和D45E处定点突变后表达的MDH,在45℃相对酶活分别为56.5%和38.6%,到65℃时的酶活损失较大,分别为28.6%和9%;未经定点突变的MDH在45℃相对酶活为45.6%,65℃的相对酶活为3.7%。说明在L225K和D45E处对MDH的定点改造没有明显提高苹果酸脱氢酶的热稳定性。对苹果酸脱氢酶的最适温度进行研究发现:未经点突变的苹果酸脱氢酶和L225K、D45E、Q229E三处点突变后的苹果酸脱氢酶最适反应温度没有变化,仍在37℃左右,相对酶活未受影响。……   
[关键词]:苹果酸脱氢酶;克隆表达;酶学性质;分泌表达;定点突变
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2010年