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利用不同底物生产1,3-丙二醇及基因工程菌的构建

马正

  1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,广泛应用于食品、医药等多个领域,其中1,3-丙二醇最重要的用途是作为合成新型聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的单体。但目前只有化学法实现了1,3-丙二醇工业化生产。与化学法相比,微生物法具有反应条件温和、对环境条件友好等优点受到广泛重视。迄今为止,自然界中的微生物只能以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇,由于原料成本较高,与化学法相比,微生物法制备1,3-丙二醇仍不具有竞争优势。为此,论文围绕“提高生产效率,降低生产成本”的研究目标,分别以Klebsiella pneumoniae,模式菌株Saccharomyces cerevisiae W303-1A和工业化甘油生产菌株Candida glycerinogenes为研究对象,采用基因工程、代谢工程和发酵工程等生物技术手段开展了应用微生物法生产1,3-丙二醇的研究,取得了以下主要研究成果: 1)为降低K. pneumoniae产1,3-丙二醇过程中由中间产物3-羟基丙醛(3-HPA)累积对菌体生长和发酵的不利影响,以氯霉素乙酰转移酶基因cat为报告基因,成功构建了K. pneumoniae新型表达系统pETPkan,并应用该表达系统在K. pneumoniae中过量表达了1,3-丙二醇氧化还原酶基因dhaT,构建了重组菌K. pneumoniae/pETPkan-dhaT。在发酵过程中,重组菌3-HPA的最大积累量与原始菌株相比,降低了约3倍,从而有效的促进了菌体生长、甘油消耗和产物合成,最终1,3-丙二醇产量为28.9 g/L,比野生菌提高了16.5%。 2)考察了摇瓶水平上初始甘油、氮源、无机盐等培养条件和pH、温度、接种量等发酵工艺条件对重组菌K. pneumoniae/pETPkan-dhaT甘油转化率和菌体生长的影响,通过单因素和正交实验设计,优化了发酵培养基组成:甘油60 g/L,酵母膏7g/L,(NH4)2SO40.3 g/L,柠檬酸8 g/L;优化了发酵工艺条件:初始pH 7.0,培养温度30℃,装液量50 mL/250 mL三角瓶,发酵接种量(v/v)6%。在优化的培养和工艺条件下,重组菌的1,3-丙二醇产量达到37.7 g/L,甘油质量转化率提高至62.8%。考察了7 L发酵罐上搅拌速度对1,3-丙二醇分批发酵实验的影响,在300 r/min的条件下,1,3-丙二醇浓度、甘油转化率分别最高达36.4 g/L,60%。7 L发酵罐补料分批发酵实验,发酵45 h后测得1,3-丙二醇产量为62.2 g/L 3)利用C. glycerinogenes生产的不同类型的甘油替代重组菌发酵培养基中的纯甘油。首先以C. glycerinogenes甘油发酵液直接作为原料,发酵结果显示,甘油发酵液中乙醇、乙酸等物质影响了菌体的生长和甘油的消耗,发酵50 h 1,3-丙二醇产量仅为8.9g/L;在添加NaCl维持高渗条件下,C. glycerinogenes发酵培养基初始葡萄糖浓度的降低有效减少了乙醇、乙酸的生成,以此发酵液作为重组菌K. pneumoniae/pETPkan-dhaT发酵底物,发酵40 h后,1,3-丙二醇产量为24.7 g/L;最后选择工业级甘油为底物发酵产1,3-丙二醇,测得1,3-丙二醇含量为33.5 g/L,甘油质量转化率为55.8%。以工业级甘油为原料, K. pneumoniae/pETPkan-dhaT 7 L发酵罐补料分批发酵,1,3-丙二醇产量达57.8g/L。以上实验结果说明工业级甘油可成为替代纯甘油发酵的廉价原料。 4)首先克隆了K. pneumoniae甘油合成1,3-丙二醇途径中8.0 kb左右大小的dha操纵子,并在大肠杆菌JM109中进行了有效表达,测得甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)比酶活分别为1.8 U/mg和0.8 U/mg,携带dha操纵子的大肠杆菌在以甘油为底物发酵时,可合成8.6 g/L 1,3-丙二醇;直接将8.0 kb dha操纵子在模式菌株酿酒酵母S. cerevisiae W303-1A中表达,由于GDHt和PDOR比酶活仅有0.4 U/mg和0.3 U/mg,最终导致在以葡萄糖为底物的发酵液中未检测到1,3-丙二醇;为增强dha基因在S. cerevisiae W303-1A中的表达,将dhaB和dhaT基因分别置于启动子GAP和转录终止子AOX1TT之间,利用游离型表达载体pYX212-zeocin在酿酒酵母中串联表达,测得重组酿酒酵母W303-BT的GDHt和PDOR比酶活分别为15.1 U/mg和12.3 U/mg;W303-BT直接以葡萄糖为底物发酵,最终测得1,3-丙二醇产量为1.2 g/L 5)将dha操纵子上的基因片段dha1 (dhaT+gdrB)和dha2 (dhaB+gdrA)分别置于启动子pGAP和AOX1TT之间,构建表达元件pGAP-dha1-AOX1TT和pGAP-dha2-AOX1TT并串联在根癌农杆菌双元载体pCAM3300-zeocin的T-DNA区域内,构建了重组质粒pGAP4。将质粒pGAP4电击导入根癌农杆菌LBA4404中,利用根癌农杆菌介导转化法(ATMT)转化C. glycerinogenes,经表型及PCR、Southern Blot验证后将遗传稳定的重组产甘油假丝酵母WL2002-GAP进行酶活检测,测得GDHt和PDOR比酶活分别为1.9 U/mmg和1.4 U/mg,以葡萄糖为底物发酵,最终测得1,3-丙二醇含量为2.9 g/L。 6)将质粒pGAP4中的启动子pGAP替换为来源于C. glycerinogenes的盐压诱导型启动子Pcggpd1,构建了质粒pGPD4。进一步通过ATMT获得了遗传稳定的重组产甘油假丝酵母WL2002-GPD,测得其GDHt和PDOR比酶活分别为5.1 U/mg和3.7 U/mg,较WL2002-GAP分别提高约2.7倍和2.6倍;以葡萄糖为底物发酵测得1,3-丙二醇为6.7g/L,较WL2002-GAP提高约2.3倍。 7)应用重组产甘油假丝酵母WL2002-GPD分别在发酵培养基添加0.5 mol/L和1mol/L NaCl的条件下发酵。结果表明,与未添加NaCl的发酵相比,随着发酵培养基中NaCl浓度的增加,重组产甘油假丝酵母WL2002-GPD GDHt和PDOR比酶活、1,3-丙二醇产量均有不同幅度的提高。……   
[关键词]:甘油;1;3-丙二醇;粗甘油;葡萄糖;克雷伯氏菌;产甘油假丝酵母;根癌农杆菌介导;盐压诱导;表达系统;补料分批发酵
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2010年