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黄绿蜜环菌生物催化白桦脂醇合成白桦脂酸的研究

刘婧

  白桦脂酸是一种具有高药理价值和保健功能的五环三萜类化合物,对艾滋病和多种肿瘤具有极大治疗功效,且对正常细胞毒性低。微生物细胞催化是解决白桦脂酸合成的有效途径,但目前相关研究甚少。本文以白桦脂醇为前体,对黄绿蜜环菌生物催化合成白桦脂酸进行了深入研究。 通过N+离子注入技术对前期研究筛选出的白桦脂酸合成菌——黄绿蜜环菌ZJUQH进行了选育改造,分离出一株高产白桦脂酸菌株(编号ZJUQH100-6),催化转化白桦脂醇底物合成白桦脂酸得率达5.34%,与出发菌株在孢子形态、菌丝体表观结构等微观形态方面存在显著差异。进一步对该突变菌株进行转化方式筛选和转化条件优化,确定白桦脂酸催化合成方式为种子预培养3d后加入底物,运用直接生长细胞体系对底物进行转化;同时通过响应面试验设计获得了最优转化条件为不添加葡萄糖,初始pH 5.0,吐温80浓度0.57%,底物浓度15 mg/L,种子培养时间3d。在此优化条件下,黄绿蜜环菌ZJUQH100-6催化合成白桦脂酸得率稳定达到9.32%。 除传统水相体系外,本文探讨了离子对体系在白桦脂酸生物催化合成中的应用,建立了黄绿蜜环菌催化合成白桦脂酸的[EMIM][BF4]/正己烷两相离子对体系:5 mL[EMIM][BF4]/正己烷两相体系(v:v=1:1)中,加入0.1 M正丁醇共基质,白桦脂醇底物75 mg/L,静息细胞浓度300 g/L(湿重),于28℃、200 r/min转化18h。在此离子对体系下,黄绿蜜环菌ZJUQH100-6合成白桦脂酸产率达12.14%,不仅有效提高了转化能力,还大大缩短了转化时间并简化了产物分离制备步骤。 为深入了解白桦脂酸的生物催化合成机理,本文对黄绿蜜环菌ZJUQH100-6催化合成白桦脂酸的关键酶系进行了初步研究,建立了菌体细胞色素P450酶系的正己烷体外诱导和还原态CO结合差光谱检测方法。在每小时投加2μL/mL正己烷,诱导9h条件下,微粒体中P420和P450浓度最高,两者之和达到6.48mmol/L。 本文还构建了生物转化体系中白桦脂醇和白桦脂酸的二维紫外-可见分光光度定性检测方法和反相高效液相色谱定量检测方法,为生物转化体系中白桦脂醇和白桦脂酸的定性、定量分析奠定基础。……   
[关键词]:黄绿蜜环菌;白桦脂酸;白桦脂醇;生物催化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2011年