手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

姜黄素对肾小管间质纤维化的干预及其机制研究

胡颖

  肾纤维化是所有肾脏疾病进展到终末期肾功能衰竭的共同病理途径,大量动物和临床试验表明,肾功能的恶化取决于肾小管间质损伤的程度和范围,肾小管间质纤维化(Tubulointerstitial Fibrosis,TIF)程度是反映肾功能下降和判断预后最重要的指标。目前全世界终末期肾功能衰竭(End Stage Renal Disease, ESRD)的患者以每年7%的速度递增,给家庭及社会带来了沉重的经济负担。进一步研究TIF的分子机制,探索有效的防治措施,对延缓ESRD的进程意义重大。 TIF是以肾小管萎缩,间质成纤维细胞增生及细胞外基质(Extra Cellular Matrix,ECM)过度积聚为特征的病理改变。肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)在TIF进程中的作用日益受到重视。许多证据表明转化生长因子-p(Transforming Growth Factor-β, TGF-β)是最重要的致纤维化细胞因子,始动并调节EMT及TIF的全过程,Smads蛋白是TGF-β细胞内信号传递分子,当TGF-β与其受体结合后可激活细胞内Smad2,Smad3并使之进入细胞核内与其它转录活化因子一起,调节靶基因的转录。 目前,防治肾纤维化尚缺乏特异性的药物。祖国医药在防治慢性肾病方面历史悠久,在探索具有抗肾纤维化作用的有效方药上取得了一定进展,但大多未能阐明其作用机制,这种对作用机制的不甚了解也影响了中药在CKD中的应用推广。寻找对RIF具有明确治疗效果的中药并阐明其疗效机制,是中药开发、中医现代化的一项重要内容。 姜黄素(curcurmin,二阿魏酰基甲烷)是植物药姜黄、郁金、莪术等的块茎中提取出来的一种酚性色素,它是一类多效的天然活性物质,来源广泛,毒性极低,在抗肿瘤和清除氧自由基方面得到广泛的应用。姜黄素对肾间质炎症和纤维化的作用如何目前并不清楚,本研究通过体内动物模型,体外细胞培养两方面观察姜黄素对肾间质纤维化的影响及可能机制,为临床防治肾间质纤维化寻找新的途径。 第一部分姜黄素对单侧输尿管结扎(Unilateral Ureteral Obstruction,UUO)大鼠肾脏病变的影响 目的:观察姜黄素对UUO大鼠肾脏病变的影响。方法:雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(Sham Operation,SOR),UUO组,姜黄素治疗组(Cur)。SOR组仅游离左侧输尿管后即缝合皮肤,UUO组和Cur组行左侧输尿管双结扎,Cur组在UUO的基础上以姜黄素液(50mg/Kg.d)腹腔内注射,SOR和UUO组使用等量助溶剂(DMSO)腹腔内注射,3组分别于术后第3,7,14天各处死5只大鼠。处死前一天收集24h尿液,处死当天收集静脉血及肾组织标本。测定左肾重,行生化指标检测;肾组织标本行HE及Masson染色,光镜下观察肾脏病理改变,评估肾小管损害及肾间质纤维化程度;用免疫组化法观察肾脏a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin, a-SMA)的沉积。结果:从大体标本上看,Cur组在对应时间点上梗阻侧肾脏的肿大及积水程度较UUO组轻,色泽较红润;3组间血清ALB, BUN, Scr,及24h尿蛋白定量无显著性差异;Cur组的肾小管间质损害程度及炎细胞浸润半定量分析显著低于UUO组(P<0.05);UUO组和Cur组梗阻肾a-SMA的表达随梗阻时间延长而逐渐增多,Cur组a-SMA的表达在对应时间点上较UUO组明显减弱,统计学上有显著性差异(P<0.05)。结论:姜黄素可显著减轻UUO大鼠梗阻侧肾脏肾小管间质的纤维化程度和炎细胞浸润,下调a-SMA的表达,对梗阻肾肾间质具保护作用。 第二部分姜黄素对肾小管上皮细胞a-SMA和PAI-1表达的影响 目的:探讨姜黄素对人近端小管上皮细胞(Human kidney proximal tubular epithelial cell-2, HK-2)纤维化相关基因a-SMA和纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)表达的影响。方法:体外培养HK-2,将实验细胞分成正常对照组、TGF-β1刺激组、姜黄素不同浓度干预组或姜黄素不同时间干预组。干预结束计数培养细胞提取细胞RNA、细胞总蛋白及培养上清液,RT-PCR、Western blot及ELISA法分别检测a-SMA和PAI-1的核酸及蛋白表达水平。结果:MTT法显示姜黄素20μmol/L浓度范围内对HK-2细胞生长无影响,正常情况下HK-2仅少量表达α-SMA和PAI-1,TGF-β1(5ng/ml)刺激下α-SMA mRNA和PAI-1mKNA的水平分别是刺激前的3.01倍和2.87倍,不同浓度姜黄素对α-SMAmRNA和PAI-1mRNA的表达产生抑制作用,以10μmol/L作用最为显著(P<0.05)。10μmol/L的姜黄素作用不同时间对上述基因表达均有抑制作用(P<0.05)。Western Blot和ELISA结果显示姜黄素可以抑制HK-2细胞α-SMA和PAI-1蛋白的表达,与TGF-β1组比较有统计学差异。结论:TGF-β1显著上调HK-2细胞α-SMA和PAI-1的mRNA水平,而且诱导细胞α-SMA蛋白及培养上清PAI-1的大量表达,姜黄素能够抑制TGF-β1刺激下HK-2细胞α-SMA和PAI-1的核酸及蛋白表达,且呈现一定的浓度和时间依赖性,初步显示其抗纤维化效应。 第三部分:姜黄素对肾小管上皮细胞TGF-β1/Smad信号通路的影响 目的:研究姜黄素对TGF-β1刺激的HK-2细胞中TGFβ1/smad信号通路的影响,以探讨姜黄素抗纤维化的分子机制。方法:体外培养HK-2细胞,Western Blot法检测TGF-β1刺激下Smad2、Smad3的磷酸化水平及核浆分布情况,再以姜黄素(不同浓度/不同时间)干预后观察上述Smads蛋白的变化;观察磷酸酶抑制剂Microcystin与姜黄素共育对Smad蛋白的影响。结果:5ng/ml TGF-β1刺激HK-2细胞的Smad2, Smad3磷酸化,同时促使Smad2, Smad3从胞浆向胞核转移。姜黄素干预可显著抑制Smad2磷酸化,作用呈浓度依赖性,但对Smad3磷酸化无影响。姜黄素可部分抑制Smad2/3信号从胞浆转入胞核,Microcystin可部分逆转姜黄素对Smad2磷酸化的抑制作用。结论:姜黄素可以通过下调Smad2/3的表达来干扰TGFβ1的细胞内信号传导,其对Smad2磷酸化的抑制作用可能与影响丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性有关。……   
[关键词]:姜黄素;肾小管间质纤维化;TGFβ1/Smad信号通路;α-平滑肌肌动蛋白;纤溶酶原激活物抑制剂-1
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2010年