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红球菌P450硫醚单加氧酶的克隆表征及应用研究

张建栋

  光学纯的亚砜化合物具有重要的应用价值,广泛被用作手性辅剂,手性催化剂及配体和手性药物。与动力学拆分外消旋亚砜相比,不对称氧化潜手性硫醚是合成光学纯亚砜最直接最经济的方法。生物催化法(微生物整细胞或酶)由于立体专一性强,反应条件温和,无毒,不会造成环境污染,受到广大研究者的重视。 本课题从实验室筛选到的一株能不对称氧化硫醚生成亚砜菌株ECU0066入手,对其种属进行了鉴定。接着对该菌种中催化硫醚氧化相关酶进行了考察。通过多序列比对设计简并引物,从该菌基因组中成功克隆得到了一段新的P450单加氧酶基因序列,染色体步移得到了该酶的全长序列。对该P450单加氧酶在大肠杆菌中进行了高效表达、纯化、表征。进一步对酶的表达条件进行了优化,利用重组菌整细胞对硫醚进行了不对称氧化。由于该酶在反应过程中需要辅酶NADPH,所以我们从一株枯草芽孢杆菌中克隆得到一个葡萄糖脱氢酶(GDH)基因序列并在大肠杆菌中进行高效表达,在体外构建了GDH和P450单加氧酶偶联的反应体系,使辅酶得到了有效再生。最后将GDH和P450单加氧酶在大肠杆菌中进行了共表达,考察了体内辅酶再生对硫醚转化的影响。 首先,对分离得到的能催化硫醚不对称氧化的菌株ECU0066进行了鉴定,通过菌落形态特征和16S rDNA序列比对,确定该菌株为红球菌(Rhodococcus sp.)。对红球菌催化特性进行分析,发现高对映选择性除了来自于硫醚的不对称氧化,随后的动力学拆分(通过氧化另一构型的亚砜为砜),使产物亚砜的对映选择性进一步提高至99%ee。在红球菌培养的指数期前期加入各种有机化合物对红球菌进行诱导,发现萘和硫醚对红球菌催化硫醚氧化的活性具有明显的诱导作用,经过诱导的细胞的酶活是未诱导的20倍以上,产物ee仍保持在99%以上。在红球菌整细胞反应体系中加入咪唑,发现其对红球菌整细胞的酶活具有明显抑制作用,证明其细胞内存在的P450单加氧酶对硫醚具有催化活性。 其次,对红球菌中的硫醚氧化酶进行了克隆,通过保守序列设计的简并引物从该菌中成功克隆得到了一段新的P450单加氧酶基因,通过染色体步移技术获得了编码该酶的全长基因序列(2361 bp),主要编码786个氨基酸。基因序列分析发现该酶属于CYP116B家族的单加氧酶,与P450RHF同源性有73%。蛋白质一级结构分析发现该酶由FMN还原酶与铁氧还蛋白和亚铁血红素部分融合在一起,是一种自给自足(self-sufficient)类型的P450单加氧酶(简写为P450SMO)。将P450SMO与pET系列载体连接转化大肠杆菌后进行表达,通过重组菌整细胞的酶活定性检测,发现P450SMO对硫醚具有明显活性,产物ee高达99%。通过镍柱对酶进行纯化,得到了该酶的纯酶,对纯酶的性质进行了表征,结果显示:P450SMO具有典型的P450酶系光谱特征;咪唑对酶活具有明显的抑制作用;P450SMO反应的最佳温度为30℃,最佳pH为7.0;对酶的热稳定性分析表明该酶稳定性较差,在较高的温度下迅速失活。对酶的底物谱进行分析,发现其对所测试的硫醚底物具有较高的活性和立体选择性,生成的亚砜产物主要为S-构型,ee在80%-99%之间,反应过程中没有砜生成。在所有测试的硫醚中,以对氯苯甲硫醚的活性最高,产物亚砜的ee高达99%。同时还发现P450SMO能催化7-乙氧基香豆素脱烃生成7-羟基香豆素。 再次,通过摇瓶培养,对重组菌P450SMO的表达条件进行了优化,考察了诱导温度、诱导剂(IPTG)量、诱导时期、诱导时间对P450SMO表达的影响,结果表明较低的诱导温度(25℃),较长诱导时间(18 h)可以有效增加酶的表达量,诱导期间加入一定量的三价铁离子可进一步提高酶的表达。经过摇瓶优化后P450SMO的表达量达到298nmol/L。在此基础上,在5L的发酵罐中对重组菌P450SMO酶的发酵进行了扩大培养,当以甘油为碳源,通过控制溶氧(小于10%),使P450SMO的表达量增加到近400nmol/L,重组菌比活力达到1.50 U/g DCW (dry cell weight)。进一步利用发酵得到的重组菌整细胞对硫醚进行了不对称氧化,优化了反应条件,在反应温度300C,pH 7.5,底物浓度150mg/L,1% DMSO作为助溶剂,葡萄糖浓度10 mM,反应12 h,转化率达到90%以上,最终得到130 mg/L的S-对氯苯甲亚砜,ee>98%。 P450SMO在反应过程中需要辅酶NADPH,但是NADPH的价格非常昂贵,导致P450SMO的应用受到了一定的限制。为降低其应用成本,本文从一株枯草芽孢杆菌中克隆得到了一个葡萄糖脱氢酶(gdh)基因序列(786 bp),编码261个氨基酸。将GDH在大肠杆菌中进行了高效表达,酶活在没有优化的条件下达到5 U/mL。将表达得到的葡萄糖脱氢酶应用于体外构建的P450SMO和GDH偶联的催化反应体系中,对底物对氯苯甲硫醚进行不对称转化,结果体系中辅酶得到有效再生,底物转化率也大大提高,在底物浓度为1 mM,反应12h后,转化率达到90%以上,产物对映选择性大于98%ee。 最后,本文采用P450SMO和GDH在宿主菌中共表达的策略,成功构建了三种P450SMO和GDH共表达系统,其中效果最好的系统为BL21 (pET28a-P450SMO-GDH),该系统P450SMO在表达量和整细胞转化硫醚的效果上均高于其它两种系统。在此基础上,对重组菌BL21(pET28a-P450SMO-GDH)的表达条件进行了优化,在诱导温度25℃,诱导时期OD6000.6,诱导剂IPTG 0.5 mM,诱导时间16h条件下,整细胞酶的比活达到2.2 U/g DCW。在底物浓度为2 mM,反应12h转化率可达100%,产物对映选择性大于98%ee。进一步将反应体系放大至100 mL,对750 mg/L的底物进行不对称氧化,结果反应12 h后产物得率达到53%。P450SMO与GDH在宿主菌中的共表达,使反应过程中辅酶在细胞内可以得到不断的再生,从而弥补了重组菌整细胞内NADPH不足的缺陷,进一步提高了反应转化效率。……   
[关键词]:红球菌;硫醚;亚砜化;克隆;P450单加氧酶;葡萄糖脱氢酶;辅酶再生
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华东理工大学2011年
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