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硫醚单加氧酶产生菌的筛选及其应用方法研究

李爱涛

  手性化合物的不对称合成或拆分已成为药物化工的研究热点和关键技术。手性亚砜由于其高度的光学稳定性,作为手性辅剂、手性催化剂配体以及起始原料,在不对称合成中具有广泛的用途。它的功能还进一步体现在一些含硫原子手性中心的手性药物中。本研究通过筛选获得一株红球菌Rhodococcus sp. ECU0066,它不仅能够高对映选择性地将硫醚氧化成手性亚砜,而且还可以对外消旋的手性亚砜进行对映体拆分。本论文研究了以目标反应为导向的筛选方法,并以芳香手性亚砜为目标产物,对来自土壤中的微生物进行了广泛的筛选;对筛选得到的红球菌ECU0066的产酶和反应特性进行了考察,并拓展了其底物谱;针对疏水性硫醚底物氧化过程中的瓶颈问题,寻找合适的解决方法,提高了细胞的利用率;对硫醚氧化和亚砜拆分两种生产手性亚砜的途径进行了比较,发现在单一的水相体系中,外消旋亚砜的拆分更具有优势。 本论文主要分为四个部分。在第一部分中,以手性亚砜为目标产物,根据目标反应建立了以目标产物为导向的筛选模型,对土壤中的微生物进行了广泛筛选。通过初筛得到了100株具有硫醚单加氧酶活性的菌株,其中能生成R构型产物的为57株;能生成S构型产物的为43株;转化率在20%以上的占60%;综合考虑活性和立体选择性因素,选定了菌株ECU0066为最终的研究对象。后续研究发现它可以通过两步对映选择性氧化,使产物(S)-苯甲亚砜的ee值从80%左右提高到99%以上。菌株ECU0066经16S rDNA鉴定为红球菌属,命名为Rhodococcus sp. ECU0066。该菌株已交由中国普通微生物保藏中心保藏,编号为CGMCC 2547。 在第二部分中,在摇瓶中对红球菌ECU0066细胞生长及产酶进程进行了考察,最佳产酶培养时间为30 h;在对数生长前期加入底物苯甲硫醚或者苯甲亚砜可以对酶活进行诱导,诱导后的酶活力提高了约10倍多(比活力由0.064 U/g提高至0.76 U/g);红球菌ECU0066中硫醚单加氧酶存在于细胞膜上,利用辅酶NADPH对硫醚进行不对称氧化。优化了红球菌ECU0066催化苯甲硫醚不对称氧化的反应条件,最适温度为30℃,pH为8.0。考察了红球菌ECU0066对底物苯甲硫醚的耐受性,发现ECU0066可以耐受的底物浓度较低,能完全转化底物的最高浓度为10 mM,葡萄糖可以作为辅底物帮助辅酶再生,葡萄糖的加入可以使20 mM的底物几乎完全转化。利用红球菌ECU0066整细胞作为催化剂,对其底物谱进行了拓展,成功地实现了一系列手性亚砜的生物制备。 在第三部分中,采用了细胞固定化和两相反应体系两种方法来缓解苯甲硫醚对细胞的抑制作用。实验结果表明:海藻酸钙固定化细胞对细胞有保护作用,细胞固定化后其半衰期提高为游离细胞的2.1倍,固定化小球内较高的含水量可以对底物起到稀释作用,缓解了底物的抑制。以固定化细胞作为催化剂,反应可以重复进行10次,底物总量达50 mM,与游离细胞所能完全转化的10 mM底物浓度相比提高了4倍。在水-异辛烷两相体系中,利用红球菌整细胞催化苯甲硫醚不对称氧化,当有机相中底物浓度为150 mM时,得到的水相中产物浓度最高,达18.3 mM,远远高于相同反应条件下单一水相体系中2.17 mM的产物浓度,并且ee值也从单一水相的59.9%提高到了99.0%以上。利用生长细胞作为催化剂,对在水-异辛烷两相体系中催化苯甲硫醚的氧化反应进行了上罐放大,反应总体系3.0 L,反应结束后水相产物的终浓度高达26.0 mM,ee>99.0%,得率为86.7%,相对于静息细胞催化的反应又有了进一步的提高。 第四部分中,对硫醚氧化和亚砜拆分两种生产手性亚砜的途径进行了比较,苯甲硫醚对细胞的毒性较大,对红球菌细胞抑制明显,最大反应速率Vmax=0.063 mmol h-1 g-1 wet cell,米氏常数Km=0.26 mM;而底物苯甲亚砜对细胞几乎没有毒性,抑制作用不明显,最大反应速率Vmax=0.27 mmol h-1 g-1 wet cell,米氏常数Km=0.69 mM。优化了红球菌细胞催化拆分苯甲亚砜的条件;反应通过采用分批补料的方式,得到产物(S)-苯甲亚砜的浓度高达37.8 mM,ee值为93.7%,远远高于苯甲硫醚氧化反应得到的结果(10 mM,80% ee);表明在单一的水相体系中,亚砜的拆分更具有优势。拓展了红球菌催化亚砜拆分的底物谱,成功地实现了四种手性亚砜和相应砜的生物制备。最后,利用生长细胞实现了苯甲亚砜拆分反应的放大制备,反应采取分批补料的方式,反应体积2.5 L,反应液中产物终浓度为21.8 mM,ee>99.0%,最后对反应的产物进行了分离纯化,得到了(S)-苯甲亚砜6.35 g,分离得率为36.2%。……   
[关键词]:红球菌ECU0066;菌种筛选;硫醚单加氧酶;不对称氧化;手性亚砜;苯甲硫醚;(S)-苯甲亚砜;两相体系;对映体拆分
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华东理工大学2011年
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