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GRIM-19抑制肺腺癌细胞株SPC-A1生长及作用机制体内外实验研究

王同

  背景: 肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤,已成为绝大多数国家癌症死亡的主要原因,目前被认为是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。按组织学分类,分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌分为腺癌、鳞癌、大细胞肺癌、鳞腺癌。其中腺癌目前占第一位。干扰素/维甲酸诱导凋亡相关基因-19(gene associated with retinoid-IFN-induced mortality-19,GRIM-19),是2000年由Angell等应用反义基因敲除的方法分离发现的一种细胞凋亡调节因子。在一些原发性肾细胞肿瘤和泌尿生殖系肿瘤中GRIM-19表达缺失或被严重抑制,用肾脏恶性肿瘤细胞系的研究证实:GRIM-19的下调通过增强依赖Stat3(signal transducers and activators of transcription 3)基因的表达而促进肿瘤生长,并且首次表明GRIM-19具有肿瘤抑制因子作用。对于GRIM-19在肺腺癌的表达情况、是否抑制其生长及抑制机制目前还没有见到相关报道。我们先期已经对GRIM-19在肺癌组织中的表达一般情况与正常肺组织表达情况做了一个对比研究,但肺腺癌中表达具体情况没有做进一步研究分析。本研究对GRIM-19和Stat3基因在肺腺癌组织与肺组织中表达作对比,采用体内外实验研究,验证GRIM-19抑制肺腺癌生长和初步探讨其作用机制。 目的: 本研究以人肺癌组织及对应的肺组织为材料,检测GRIM-19、Stat3及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、Cyclin D1在肺腺癌及正常肺组织中的表达情况;对pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc质粒进行测序,分别将pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc和pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc真核表达质粒转染SPC-A1细胞中,建立稳转细胞株SPC-A1/GRIM-19和SPC-A1/CON,将上述两种细胞分别种植于不同组的BALB/C裸鼠皮下,28天杀死裸鼠,取出皮下肿瘤组织,分别检测GRIM-19、Stat3及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、Cyclin D1等的表达。在体内外验证GRIM-19抑制肺腺癌生长及其作用机制。 方法: 收集肺腺癌和对应的肺组织标本,用免疫组化方法比较肺腺癌组织和对应肺组织中GRIM-19蛋白表达。再用Western blot法比较肺腺癌和肺组织GRIM-19、STAT3蛋白的表达。分别抽取37例患者肺腺癌组织及肺组织中的总RNA,然后采用RT-PCR法比较肺腺癌组织和正常肺组织中GRIM-19、Stat3及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、Cyclin D1的mRNA表达。 中国科技大学生命科学学院肖卫华教授馈赠PIRES-Puro2-GRIM-19-Myc和PIRES-Puro2- Myc真核表达质粒,上海生工对此进行测序,判断是否有基因突变。Lipofectamine将真核表达质粒pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc和pIRES-Puro2-Myc转染肺腺癌细胞株SPC-A1中,建立稳转细胞株。用MTT方法检测GRIM-19是否对肺腺癌细胞株SPC-A1的生长影响。用Western blot法比较稳转细胞株SPC-A1/GRIM-19和SPC-A1/CON的GRIM-19和STAT3蛋白表达。然后采用RT-PCR法分别比较稳转细胞株SPC-A1/GRIM-19和SPC-A1/CON的GRIM-19、Stat3及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、Cyclin D1、VEGF的mRNA表达。通过上述方法,在体外实验判断GRIM-19是否抑制肺腺癌细胞株的生长及其机制。 分别取SPC-A1/GRIM-19, SPC-A1/CON (2×106)种植于5周的BALB/C裸鼠(雌性),观察4周,每隔7天检测一次其体积变化,用体内实验判断GRIM-19是否对肺腺癌细胞株SPC-A1的生长影响。第28天分别取不同组BALB/C裸鼠的皮下肿瘤组织,用Western blot法比较其GRIM-19、STAT3和MMP2蛋白表达。分别提取不同组BALB/C裸鼠的皮下肿瘤组织的总RNA,然后采用RT-PCR法比较其GRIM-19、Stat3及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、Cyclin D1、VEGF的mRNA表达情况。通过上述方法,在体内实验判断GRIM-19是否抑制肺腺癌细胞株的生长及其机制。 结果: 一、GRIM-19、STAT3及其下游靶基因在肺腺癌组织和肺组织中的表达用免疫组化检测结果显示:GRIM-19蛋白在肺腺癌组织表达明显低于在肺组织表达。Western Blot结果表明:肺腺癌组与肺组织组相比,GRIM-19蛋白表达水平在肺腺癌中明显低于肺组织,差异有统计学意义(p<0.01)。STAT3蛋白表达与之相反。RT-PCR结果表明:肺腺癌组与肺组织相比,GRIM-19基因表达水平明显减低,差异有统计学意义(p<0.01);与之相反,RT-PCR结果发现Stat3及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、Cyclin D1的表达在肺腺癌组织中高于其肺组织中。 二、GRIM-19抑制肺腺癌细胞株SPC-A1生长体外实验结果 上海生工对对PIRES-Puro2-GRIM-19-Myc真核表达质粒测序无基因突变。用Lipofectamine将真核表达质粒pIRES-Puro2-GRIM-19-Myc和pIRES-Puro2-Myc转染肺腺癌细胞株SPC-A1中, G418(浓度0.60μg/mL)持续筛选6周建立稳转细胞株: SPC-A1/GRIM-19和SPC-A1/CON。Western Blot结果表明:SPC-A1/GRIM-19细胞株与SPC-A1/CON细胞株相比, SPC-A1/CON细胞株中的GRIM-19蛋白水平表达明显低于SPC-A1/GRIM-19细胞中的表达,差异有统计学意义(p<0.01)。STAT3蛋白表达与之相反。RT-PCR结果表明:SPC-A1/GRIM-19细胞株与SPC-A1/CON细胞株相比, SPC-A1/CON细胞株中的GRIM-19表达水平明显低于SPC-A1/GRIM-19细胞株中的表达水平,差异有统计学意义(p<0.01),RT-PCR结果发现Stat3及其下游靶基因Bcl-2、CyclinB1、CyclinD1,VEGF的mRNA表达与之相反。 三、GRIM-19抑制肺腺癌细胞株SPC-A1生长体内实验结果 把SPC-A1/GRIM-19和SPC-A1/CON细胞分别种植于BALB/C裸鼠皮下,每周检测其肿瘤大小,构建其生长曲线,结果显示:种植SPC-A1/GRIM-19细胞的BALB/C裸鼠的皮下肿瘤的体积明显减小(p<0.01)。4周后分别取不同组BALB/C裸鼠的皮下肿瘤组织用Western blot法检测其GRIM-19、STAT3和MMP2蛋白,结果表明:种植SPC-A1/GRIM-19细胞的BALB/C裸鼠的皮下肿瘤组织与种植SPC-A1/CON细胞的BALB/C裸鼠的皮下肿瘤组织相比: GRIM-19的蛋白水平在SPC-A1/CON细胞的瘤组织中的表达明显低于SPC-A1/GRIM-19细胞的瘤组织的表达,差异有统计学意义(p<0.01)。STAT3、MMP2的蛋白表达与之相反。RT-PCR结果表明:种植SPC-A1/GRIM-19细胞的BALB/C裸鼠的皮下肿瘤组织与种植SPC-A1/CON细胞的BALB/C裸鼠的皮下肿瘤组织相比:GRIM-19的mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(p<0.01); Stat3及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、Cyclin D1,VEGF的mRNA表达水平与之相反。 结论 1.肺腺癌组GRIM-19的mRNA水平及蛋白水平明显低于其在相对应的正常肺组织的表达,并且基因表达水平的降低伴随有蛋白表达的相应下降;肺腺癌组Stat3的mRNA水平及蛋白及其下游靶基因Bcl-2、Cyclin B1、CyclinD1、VEGF基因表达水平均高于其在肺组织中的表达。 2.通过建立肺腺癌稳转细胞株SPC-A1/GRIM-19和SPC-A1/C0N,在体外验证GRIM-19抑制肺腺癌生长。 3.把SPC-A1/GRIM-19和SPC-A1/CON稳转细胞株分别种植不同组BALB/C裸鼠的皮下,在体内验证GRIM19抑制肺腺癌生长。……   
[关键词]:干扰素/维甲酸诱导凋亡相关基因-19;信号转导子与转录激活子-3;肺癌;腺癌;肺腺癌细胞株
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:安徽医科大学2010年
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