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基因治疗用质粒DNA生产及产物纯化的研究

韩依辰

  大量国内外研究表明IL-24基因具有广谱抗肿瘤活性,对黑色素瘤、子宫颈癌、肺癌、前列腺癌等肿瘤细胞均有抑制作用。因此含有IL-24基因的质粒具有潜在的,临床治疗肿瘤的应用前景。大规模制备、纯化药用级含IL-24基因的质粒DNA是其应用于基因治疗的关键。本论文系统地研究了含有重组质粒pcDNA3.1-IL-24工程菌的构建、发酵、大规模裂解条件,重组质粒pcDNA3.1-IL-24分离纯化路线以及质量检测体系的建立。 首先我们将已构建好的重组质粒pcDNA3.1-IL-24转化大肠杆菌E.coli DH5a,构建rh-IL-24工程菌,考察工程菌的传代稳定性后,在BIOFLO 40L发酵罐中,通过补料分批发酵的方式,流加发酵培养液,控制发酵温度在36℃-38℃之间、发酵培养对数生长期溶解氧浓度控制在30%-50%之间,PH保持在7.0左右的发酵参数上罐发酵。16h结束发酵后,收获菌体约为36g湿菌体/L。离心收集菌体,使用碱裂解法大量制备粗制质粒DNA,先通过盐沉淀法粗纯质粒DNA,然后使用离子交换层析、疏水层析、分子筛层析进一步纯化,最后进行无菌超滤,将质粒DNA浓缩到药用剂量后分装到安瓿里保存。 依照国家食品药品监督局颁布的《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》,我们建立了相应的检测体系,对质粒DNA产品进行质量鉴定,结果表明,本工艺制备的质粒DNA外观澄清、无杂质;pH值为7.2;质粒DNA浓度为727μg/mL;纯度(OD260/OD280)为1.87;杂质蛋白含量为O.007μg/μg质粒DNA;无RNA和抗生素残留;细菌内毒素小于0.007EU/μg质粒DNA。检测结果符合药用标准。与传统实验室方法相比,本工艺生产流程避免使用有毒试剂(苯酚、氯仿)和动物源性酶类(RNase A),确保了产品的安全性的同时,也减少了检测有毒试剂残余量的繁琐步骤;本工艺使用的大都是价格低廉的国产试剂,所用的材料和设备(凝胶、反应器等)可以反复再生使用。生产周期较短,满足了实际生产需求,具有良好的经济性;此外,本工艺操作简单、易于放大、重复性好,并且建立了相应的质粒DNA质量检测体系,对于药用级质粒DNA大规模制备具有重要的现实意义,也为同类研究的进行奠定了理论基础,为进一步的工业化生产提供了借鉴。……   
[关键词]:质粒DNA;IL-24;发酵培养;纯化;质量检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:长春工业大学2010年