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重要植物疫害的检测鉴定及分子系统学研究

廖芳

  有害生物入侵已成为对生物多样性构成严重威胁的第二大因素,仅次于生态环境的破坏,引起世界各国普遍关注。我国是农产品贸易的第四大进口国和第五大出口国,是全球受外来生物入侵影响最大的国家之一,随着我国对外贸易的进一步扩大,植物及其产品的调运日趋频繁,伴随着旅游业的大发展,外来有害生物入侵的形势愈加严峻,已经成为危害我国生物多样性、生态环境和国民经济的一个十分重要和紧迫的问题。加强口岸检疫,构筑防范外来疫害入侵的第一道屏障,对保障我国农业生产安全,服务于农产品的出口和国内贸易具有重大的现实意义。 近年来,顺应城市园林绿化和农牧业的需求,国外大量草种进入我国,尤其早熟禾、黑麦草、雀麦、紫羊茅和翦股颖等禾本科草种进口量大,它们是腥黑粉菌的重要寄主,腥黑粉菌严重影响其产量和品质,其中小麦矮腥黑穗病(Tilletia controversa Kuhn, TCK)是我国规定禁止进境的植物检疫性有害生物,既为害小麦,又感染多种禾本科草种。这些草种还传带其它在我国尚未发生的腥黑粉菌,作为土传种带真菌病害,一旦传入,防治、根除非常困难。本研究建立了黑麦草上3种具网纹状、冬孢子形态相似的腥黑粉菌TCK、T. lolii及T. vankyi的三重PCR检测方法,用于检测菌丝和冬孢子基因组DNA,实现对三种腥黑粉菌的同时检测,降低了检测成本,便于口岸推广应用;建立了雀麦上T.bromi的分子检测方法,用于检测菌丝和冬孢子基因组DNA;建立了翦股颖上T. sphaerococca和TCT菌丝的双重PCR和冬孢子的套式双重PCR检测方法;建立了紫羊茅上T. vankyi分子检测方法,用于检测菌丝和冬孢子基因组DNA;建立了早熟禾上T.sp.和T. fusca菌丝的双重PCR和冬孢子的套式双重PCR检测方法,并基于IGS1基因的Tilletia属的系统进化分析显示T.sp.与T. bromi的亲缘关系较近,与T. fusca亲缘关系相对较远;针对禾本科草籽上2种腥黑粉菌新种T. vankyi和T. puccinelliae进行了形态学及萌发生理特性的研究。研究结果被纳入2篇新种发布的文献;并进行了2个新种基于IGS1基因序列的系统进化分析,结果与2篇新种发布文献的结论一致;建立了黑麦草、雀麦、翦股颖、紫羊茅和早熟禾5类禾本科草种上腥黑粉菌的检疫鉴定程序。 大豆是我国重要的粮食作物,近年来进口量激增。菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,bpMV)是我国规定禁止进境的植物检疫性病毒,能导致大豆品质降低和产量下降,可随种子进行远距离传播,是大豆上一种非常重要的种传病害,我国未分布。本研究针对进口大豆BPMV的检测,建立了一步法RT-PCR和一步法实时荧光RT-PCR检测方法。依据BPMV的外壳蛋白编码基因设计了特异引物和特异Taqman探针,特异引物的扩增片段约为500bp,阳性质粒的实时荧光PCR方法的检测下限为20fg/μL,是一步法RT-PCR方法的100倍,检测时间由至少8h缩短至4h,一步法实时荧光RT-PCR方法具有快捷、灵敏、准确和简便的特点,适于口岸检测;种脐色斑与病毒携带相关性分析表明,种脐褐色斑驳的大豆种子BPMV检测呈阳性,大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)检测呈阴性,种脐黑色斑驳的大豆种子SMV检测呈阳性,BPMV检测呈阴性,种脐褐色斑驳的大豆种子DAS-ELISA检测表明不携带其它8种大豆种传病毒;基于BPMV的外壳蛋白编码基因的系统进化分析表明从进境美国大豆截获的BPMV分离物可能归属于亚组Ⅱ。 美国白蛾(Hypantria cunea Drury)是世界性检疫害虫,适应性强,食性杂,给森林树种、园林绿化树种及果树造成严重危害。线粒体基因组具有基因组小、基因组成稳定、普遍为母性遗传和较少发生重组等特点,成为基因组学和进化研究的理想材料。相对于鳞翅目庞大的类群,已测定的鳞翅目线粒体基因组的种类非常有限,因此,对鳞翅目线粒体基因组进行测序和分析,对揭示鳞翅目线粒体基因组的进化以及研究鳞翅目超家族间复杂的系统发育关系具有重要意义。本研究对美国白蛾进行了线粒体基因组全序列的测定,其线粒体全基因组序列为15481bp,环状双链,具有鳞翅目线粒体基因组典型的基因构成和顺序;其tRNAMet基因易位到tRNAIle基因的5′端上游位置,与果蝇中推定的昆虫祖先基因排列存在差异;mtDNA组成偏好于碱基A和T,AT含量高达80.38%,其AT组成偏好性呈现出弱阳性(0.010),表明AT碱基中偏好使用A;13个蛋白编码基因中,除COI之外的所有蛋白编码基因均以典型的ATN作为起始密码子,美国白蛾的COI基因起始密码子暂定为CGA,13个蛋白编码基因中有4个采用了不完整的T或者TA作为终止密码子;tRNASer(AGN)的二氢尿嘧啶臂(DHU)不能形成稳定的茎环结构,其他所有的tRNAs都具有线粒体tRNA典型的三叶草二级结构;在tRNASer(AGN)和ND1之间的基因间隔区序列具有鳞翅目保守的ATACTAA模序;美国白蛾357bp的A+T富集区由非重复性序列构成,其特征序列包括ATAGA模序后紧随18bp的poly-T stretch, ATTTA模序后紧随的微卫星样的(AT)8单元,最后是一个11bp的poly-A位于tRNAMet基因上游;根据已有鳞翅目昆虫线粒体基因组序列进行的系统发育分析表明,三种夜蛾总科昆虫中,美国白蛾与舞毒蛾亲缘关系较近,与大袋蛾亲缘关系较远,结果还支持夜蛾总科(美国白蛾、舞毒蛾和大袋蛾)与尺蛾总科(桑尺蠖)是单系发生的假说,然而凤蝶总科(褐脉粉蝶、苎麻珍蝶和纹蝶)处于鳞翅目单系的基部,这一结果与传统分类结论不同。 高梁属中有重要的粮食作物和优良牧草,也有我国规定禁止进境的三种检疫性杂草假高粱、黑高粱和丝克高粱。根据GenBank中高粱Sorghum bicolor的adh1全基因设计引物,扩增并测定了8个植物材料约2000bp的adhl基因部分序列,结合GenBank中24个Sorghum属种的同源序列,分别构建了MP、ML和NJ三种分子进化树,得到了基本相同的拓扑结构,结果表明:(1)高梁属可明显分为三大支,一支是Eusorghum亚属,一支是Chaetosorghum和Heterosorghum两个亚属,这两个分支包含2n=20、40,染色体较小的种类,另一分支包括Parasorghum和Stiposorghum两个亚属,包含2n=10的种类和它们的多倍体近缘种,染色体相对较大;(2)Eusorghum亚属中,三种检疫性杂草S. halepense、S. almum、S. silk与其它形态近似种S. bicolor及其亚种S. arundinaceum、S.sudanense、S. propinquum聚为一类,与形态学的研究结论一致,S. silk、S. sudanense和S. almum表现出较近的亲缘关系;(3)S. almum的Adh1基因表现出明显的地理分化;(4)Parasorghum亚属的S. purpureosericeum和S. versicolor、S. nitidum和S. leiocladum聚在一起,而该亚属中的S. matarankense、S. grande、S. timorense却与亚属Stiposorghum的种聚在一起,表现出更近的亲缘关系;(5)S. macrospermum和S. laxiflorum之间具有最近的亲缘关系。 本研究建立了口岸经常截获、已对我国农业生产造成现实威胁的5类禾本科草种上腥黑粉菌、大豆种传菜豆荚斑驳病毒的分子检测技术,用于口岸近缘种及株系的甄别、国内田间病害早期诊断和疫情动态监测,并对网状腥黑粉菌、菜豆荚斑驳病毒、美国白蛾、高粱属中3种检疫性杂草进行了分子系统学研究。研究结果有助于从分子水平阐明种间的系统进化关系及病毒的株系分化,不仅具有重大的理论意义,同时在农业植保实践中也具有重要的应用价值,以明确其分类地位,补充和完善传统分类方法,为检疫提供分子水平依据。本研究对于增强我国防范农业植物外来疫害入侵和扩散的检疫监控能力,提高我国农业植物疫害生物检验检疫整体水平,确保农产品的生产安全,促进农产品顺利出口具有重要的政治意义和经济意义。……   
[关键词]:禾本科草种;大豆;腥黑粉菌;菜豆荚斑驳病毒;美国白蛾;高粱属;检疫性杂草;分子检测;线粒体基因组;分子系统学
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南开大学2010年