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疏水蛋白HGFI的表达、功能应用及自组装机制研究

王泽方

  疏水蛋白是丝状真菌产生的小分子量蛋白质,其最大特点是能够在界面形成一层双亲性的蛋白膜以此来反转所覆盖界面的性质。自组装的疏水蛋白应用非常广泛,例如在乳化、蛋白分离技术、生物传感器和生物芯片等领域。在前期研究中,本研究室从真菌灰树花平皿菌丝中发现了一个新的疏水蛋白HGFI。随着对HGFI蛋白研究的不断深入,遇到以下三个问题:一是HGFI蛋白的大规模生产和纯化问题;二是需要发展HGFI蛋白应用的新方向;三是HGFI蛋白的自组装及固定外源生物分子的机制不明。这三个问题也是疏水蛋白研究领域所面临的共同问题。在本文的第二章到第六章将系统研究以上三个问题。 在第二章中,进行了HGFI在大肠杆菌中的表达纯化与性质研究工作。hgfI基因被克隆到了pET-28a表达载体中,随后被转化进入大肠杆菌BL21菌株SDS-PAGE电泳显示,经过优化诱导所用IPTG的用量和时间之后,重组HGFI蛋白主要以包涵体形式表达。随后利用电洗脱技术对包涵体中HGFI进行了纯化。接触角测量表明,经过复性的重组HGFI蛋白具有部分自组装活性。纯化后的HGFI被用于生产多克隆抗体,ELISA和Western结果显示HGFI的多克隆抗体不仅能够识别大肠杆菌表达的重组HGFI,还可以识别产自灰树花菌丝的天然HGFI。最后利用免疫荧光技术对HGFI蛋白在灰树花菌丝进行了定位,结果显示HGFI不但出现在灰树花菌丝的细胞壁上,还出现在了菌丝出芽的位置。该结果表明HGFI蛋白在灰树花的菌丝细胞壁形成和出芽过程中起了重要作用。 在第三章中,进行了HGFI在毕氏酵母中的表达纯化与性质研究工作。hgfI基因被克隆到了pPIC9表达载体中,随后被转化进入了毕氏酵母GS115菌株。SDS-PAGE、Western以及MALDI-TOF质谱结果显示大小在8 KDa左右的重组HGFI被分泌到了培养基中。通过控制甲醇的浓度和诱导时间,HGFI蛋白的表达条件得到了优化。超滤和高压液相色谱被用来纯化HGFI蛋白。经过以上两个步骤的纯化,每升酵母发酵液能得到86mg的HGFI蛋白。X射线光电子能谱和接触角测量实验表明重组HGFI可以在疏水的硅烷化玻璃、特氟龙以及亲水的云母表面自组装成膜。细胞毒性测试表明自组装的HGFI蛋白膜具有良好的生物相容性,可以帮助人主动脉平滑肌细胞在组织工程材料-聚己内酯上更好的增殖。 在第四章中,进行了HGFI分散多壁碳纳米管及固定抗体分子的应用研究。经过30 min的超声,多壁碳纳米管能够分散在0.1 mg/mL的HGFI溶液中。光学吸收和透射电镜实验表明多壁碳纳米管的分散溶液很稳定。X射线光电子能谱、红外光谱、拉曼光谱和热重分析实验表明了HGFI能够通过疏水作用力,非共价地吸附在多壁碳纳米管表面,使其表面呈现亲水性。石英晶体微天平和免疫分析实验表面了HGFI修饰的多壁碳纳米管可以用来在溶液中固定免疫球蛋白G。 在第五章中,进行了利用亲水带电的HGFI膜修饰聚苯乙烯表面及其在时间分辨免疫荧光分析中的应用研究。石英晶体微天平实验表明在pH 5时,经过两个吸附阶段,疏水蛋白HGFI可以在聚苯乙烯表明形成一层带负电的亲水单层膜。X射线光电子能谱和接触角测量实验表明自组装的疏水蛋白可以使得聚苯乙烯表面在3个月内保持亲水性。原子力显微镜实验表明,聚苯乙烯表面的粗糙度在HGFI吸附后变小,抗体分子以“直立”的形式在亲水的疏水蛋白膜上形成了致密的单层膜。而在疏水的聚苯乙烯表面上,抗体分子以“侧立”形式形成了疏松的多层膜。时间分辨免疫荧光分析显示在HGFI修饰的聚苯乙烯表面,癌胚抗原检测的线性范围为15-600 ng/mL。不同检测批次和批间的标准偏差在4%以内。以上结果表明时间分辨免疫荧光分析在HGFI修饰过聚苯乙烯表面具有很高的灵敏性。 在第六章中,通过石英晶体微天平技术系统地研究了在不同pH和离子强度条件下,两种疏水蛋白在巯醇表面的自组装以及疏水蛋白固定外源生物分子的机制。实验结果表明:第一,Ⅰ型疏水蛋白和Ⅱ型疏水蛋白的自组装过程和结果都不同。Ⅰ型蛋白的自组装受静电力影响较大,在巯醇表面主要形成“弹性膜”。Ⅱ型蛋白的自组装受静电力影响较小,在巯醇表面主要形成“刚性膜”。第二,外源蛋白在疏水蛋白表面的固定化主要依靠静电力驱动。通过改变pH和离子强度,可以有效控制外源蛋白在疏水蛋白膜上的吸附。随后的研究利用了以上结论制备了基于疏水蛋白的用于检测C-反应蛋白的压电型免疫传感器。 通过以上的研究工作,解决了疏水蛋白的大规模生产和纯化问题,指出了疏水蛋白应用的新方向,并且阐明了疏水蛋白自组装和固定化的机制。本文的研究工作为更加深入的研究疏水蛋白提供了物质和理论基础。……   
[关键词]:真菌疏水蛋白HGFI;原核与真核表达;碳纳米管;聚苯乙烯;固定化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南开大学2010年