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大豆球蛋白糖基化接枝改性及其热聚集行为研究

许彩虹

  基于Maillard反应机理的蛋白质和多糖糖基化研究是蛋白质改性方法的一种绿色有效方法,然而由于其糖基化方法的一些局限性,难以实现可控性和工业性应用,如何对现有糖基化方法进行分析比较并进行更好地改进,成为目前所关注的热点,并且蛋白质经过糖基化以后,研究其对蛋白质热聚集性质的影响进而达到通过糖基化控制蛋白质的热聚集行为,也是改善大豆蛋白热性质研究领域的重要课题。本文系统地研究了大豆7S球蛋白和葡聚糖不同糖基化方法的反应机制差异,以及不同糖链长度对糖基化产物性质和构效方面的影响,探讨了糖基化分别对于大豆7S球蛋白自身热聚集、凝胶性和大豆11S球蛋白热聚集性质的影响。 水热法采用的压力能够抑制Maillard反应向高级阶段的进行,并且水热法产物的主要功能特性与湿热法相比有相应的提高,表明压力对于Maillard反应的进行具有一定的抑制作用,可以控制糖基化反应向理想阶段进行。 三种糖基化制备方法的反应程度顺序依次为:湿热法>水热法>干热法,干热法反应环境拥挤,反应条件温和,产物主要形成于Maillard反应的初期后期和中期初期,即理想的反应阶段,湿热法反应剧烈,易于发生蛋白质肽链的聚集和展开,加速了Maillard反应的进行,产物多形成于Maillard反应的高级阶段。水相体系比固相体系对于蛋白质空间结构影响更大,通过对二级结构研究发现,湿热法和水热法的制备产物α-螺旋含量均减少,三级结构研究显示,干热法对于三级结构的变化影响不明显,然而湿热法和水热法对于蛋白质分子的三级结构有显著的影响,处于分子内部疏水区的酪氨酸由于蛋白质肽链的展开而逐渐暴露在肽链表面。 大豆7S球蛋白经过糖基化后热变性温度得到了提高,三种糖基化产物G67、G150和G500的变性峰值温度Tp分别为84.81±0.47°C、87.34±0.31°C和86.32±0.27°C,热变性焓值?H分别为5.271±0.48、7.612±0.25和7.795±0.19 J/g。 在大豆7S球蛋白的热聚集宏观聚集体研究中,糖基化抑制了大豆7S球蛋白对于pH值和离子强度诱导的热聚集宏观聚集体的形成。大豆7S球蛋白糖基化产物在加热过程中,糖基化反应生成的大分子可溶性聚合物会解聚成热稳定性更好的小分子聚合物从而提高了大豆7S球蛋白溶液的热稳定性,G67和G150的抑制效果差异不大,G500抑制效果略低于前两者。 以共价键形式结合入蛋白质肽链的葡聚糖,一定程度上改变了蛋白质的空间结构。在二级结构中,糖链的引入不会改变大豆7S球蛋白的主要结构(β-结构),主要增加了蛋白质二级结构中的无规则卷曲结构;三级结构中,随着糖链的延长,引进较大的空间位阻,较大程度地屏蔽掉近紫外区有信号的芳香族氨基酸原二信号,尤其是苯丙氨酸特征信号逐渐减少。 葡聚糖以非共价键接入蛋白质肽链和以共价键接入的糖链所起的空间位阻作用给予大豆7S球蛋白热致凝胶体系的作用不同,葡聚糖以非共价键接入蛋白质肽链中,其空间位阻效应有利于热致凝胶性质的提高,以共价键结合的葡聚糖的空间位阻效应有利于保护蛋白质发生热变性而形成凝胶。以共价键结合的葡聚糖能够和蛋白质分子均匀的分布在凝胶网络结构中,不会引起相分离,以非共价键混合的葡聚糖不均匀的分布在蛋白质分子的凝胶网络结构中,随着混入葡聚糖分子量的增大,引起的相分离行为越明显。 糖基化提高了大豆7S球蛋白对于大豆11S球蛋白热聚集行为的抑制作用,三种糖基化产物的抑制作用差异性并不强,糖基化大豆7S球蛋白对于大豆11S球蛋白的抑制作用在葡聚糖分子量为67-500 kDa时,忽略了接入糖链的长度差异。糖基化大豆7S球蛋白在加热过程中形成了分子量相对加热前更小但是热稳定性更好的糖基化产物,在大豆11S球蛋白分散液加热后,这部分糖基化产物和大豆11S球蛋白的碱性亚基生成一类热稳定性更好的混合物。在较为极端的条件下(pH值或离子强度)糖基化大豆7S球蛋白比未糖基化大豆7S球蛋白抑制大豆11S球蛋白的热聚集效果更好,并且作用机制不同,主要是由于接入亲水性的葡聚糖所带来的在溶液中的空间占位效应,增大了大豆11S球蛋白碱性亚基热聚集的阻力,从而抑制其热聚集行为。……   
[关键词]:大豆7S球蛋白;葡聚糖;糖基化;热聚集;大豆11S球蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华南理工大学2010年
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