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Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化潜手性酮不对称还原反应的研究

肖仔君

  手性醇是重要的的手性中间体,可广泛应用于手性药物和功能材料的合成。如对映体纯的(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇{(R)-TMSBL}可用于合成治疗老年痴呆症药物的中间体(R)-苯甲基-4-羟基-2-戊炔酸。 与化学合成法相比,生物法反应条件温和、立体选择性高、环境友好,故日益受到人们的青睐。全细胞催化无需添加昂贵的辅酶,同时酶和辅酶都被保护在天然的细胞环境中,有利于保持其活性。因此,利用微生物细胞催化潜手性4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮(TMSBO)不对称还原合成对映体纯的(R)-TMSBL具有重要的意义。近年来的研究发现,许多酶和微生物细胞在含离子液体介质中具有较高的活性、选择性和稳定性。基于以上情况,本论文从可能遵循反Prelog规则催化TMSBO不对称还原合成(R)-TMSBL的微生物样品中筛选高效菌株,通过对比研究不同介质中该微生物细胞催化TMSBO不对称还原反应特性,阐明不同离子液体对该反应的影响规律及机理,揭示在含离子液体介质中该微生物细胞的催化特性,并建立可用于高效、高选择性合成对映体纯(R)-TMSBL的生物催化反应体系。 从可能遵循反Prelog规则催化TMSBO不对称还原反应的微生物样品中,筛选到多株能催化TMSBO不对称还原的微生物菌株。经复筛发现,从“中华开菲尔”菌粒中筛选得到的微生物菌株XZY003催化TMSBO不对称还原生成(R)-TMSBL的效果最好。通过微生物形态、生理生化特性和16S rDNA基因序列逐级鉴定出菌株XZY003属于Acetobacter ghanaensis或其亚种,命名为Acetobacter sp. CCTCC M209061。与已报道的遵循反Prelog规则的微生物相比,在TEA-HCl缓冲液反应体系中Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原生成(R)-TMSBL的效率最高; Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原反应的最适条件为:pH值5.0,辅底物为异丙醇,其浓度130.6 mmol/L,反应温度30℃,底物浓度6.0 mmol/L以及振荡速度180 r/min;在此条件下,反应的初速度、最大产率及产物的e.e.值分别可达0.50μmol/min、71%和99%以上。此外,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞能催化其它一系列潜手性酮不对称还原生成对映体纯手性醇。试验表明,水相中存在较为严重的底物和产物抑制,导致最大产率和最适底物浓度较低。 为解决这一问题,通过代谢调控途径,利用咪唑类离子液体能改善细胞膜通透性的特性,在反应体系中添加与水互溶的咪唑类离子液体,以改变底物和产物在细胞内的浓度,进而提高底物浓度和产率;同时探讨不同亲水性离子液体对Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原反应的影响规律。研究表明,组成离子液体的阴、阳离子类型对Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原反应有较大影响,特定阴阳离子的匹配对其发挥最佳催化效果至关重要。当组成离子液体的阴离子为BF_4~-和TfO-时,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞的催化活性较低;当阳离子为C_nMIM~+时,随着n值的增加,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞的催化活性呈下降趋势;只有当C_2OHMIM+和NO_3-匹配时,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞的催化活性最高。在含离子液体C_2OHMIM·NO_3的反应介质中,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO的不对称还原反应的最适底物浓度可达9.0 mmol/L,反应初速度达1.7μmol/min,最大产率为91%,均高于水相体系的对应值,并且产物的e.e.也保持99%以上。此外,在含C2OHMIM·NO_3介质中,Acetobacter sp. CCTCC M209061能高效地催化一系列潜手性酮不对称还原反应。在所考察的15种亲水性离子液体中,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞在含离子液体C2OHMIM·NO_3介质中具有较高的糖代谢活性和适宜的细胞膜完整性,表明C_2OHMIM·NO_3对Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞具有较好的生物相容性,同时该离子液体可能适度地改善细胞膜的通透性,有助于生成的产物迅速运输到胞外,部分解除产物的抑制和降低其对细胞的毒性作用。这很好地解释了在含C2OHMIM·NO_3介质中细胞催化效率较高。但是,该反应的最适底物浓度仍较低(9.0 mmol/L),最大产率有待于进一步提高。 为此,尝试采用相转移的方法,利用第二相对底物和产物的萃取作用,解决上述问题。有机溶液/缓冲液是常见的双相反应体系,故首先在不同有机溶剂与TEA-HCl缓冲液组成的双相体系中进行Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原反应。在所研究的有机溶剂范围内,当其Log P低于3.5时,该不对称还原反应的初速度和最大产率随着有机溶剂Log P值的升高而升高;Log P高于3.5时,该不对称还原反应的初速度和最大产率随着有机溶剂Log P值的升高而降低。与其他有机溶剂相比,正己烷为最适有机介质。在正己烷/TEA-HCl缓冲液双相反应体系中,该反应的初速度最高为1.8μmol/h,产率最大为90%。显然,正己烷/TEA-HCl缓冲液不能有效地提高反应效率。实验表明,有机溶剂对Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞的毒性较大,导致细胞的催化活性及稳定性大大下降。 用具有良好生物相容性的疏水性离子液体替代有机溶剂作为萃取相可提高细胞活性。为此,研究了不同疏水性离子液体对Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原反应的影响。在所研究的疏水性离子液体中,C_4MIM·PF_6最适充当该反应的第二相。在TEA-HCl缓冲液/C_4MIM·PF_6双相反应体系中,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞催化TMSBO不对称还原反应的最适条件为:缓冲液与C_4MIM·PF_6两相体积比4:1,底物浓度60.0 mmol/L,缓冲液pH值5.0,辅底物浓度555.7 mmol/L,反应温度30℃,振荡速度200 r/min。在此条件下,反应初速度为9.4μmol /h,最大产率和产物e.e.值分别达到93%和99%以上。与正己烷/缓冲液双相体系相比,最适底物浓度(60.0 mmol/L vs. 9.0 mmol/L)和最大产率(93% vs. 90%)均有所提高。在所研究的范围内,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞在TEA-HCl缓冲液/ C_4MIM·PF_6双相反应体系中的糖代谢活性,且细胞膜较为完整,表明C_4MIM·PF_6对Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞具有较好的生物相容性;另外,离子液体C_4MIM·PF_6对底物和产物具有较高的萃取效率,这很好地解释了Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞在TEA-HCl缓冲液/C_4MIM·PF_6双相体系中催化TMSBO不对称还原反应的效率较高这一现象。另一方面,红外光谱法分析表明,离子液体C_4MIM·PF_6能进入Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞内,且在细胞膜中富集,提示该离子液体可能与胞内的醇脱氢酶系存在相互作用。此外,在缓冲液/C_4MIM·PF_6双相体系中,Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞能高效催化其它一系列潜手性酮不对称还原反应。 在以上所考察的四种反应体系中, Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞在缓冲液/C_4MIM·PF_6双相反应体系中的操作稳定性最好,而在正己烷/缓冲液双相反应体系中的操作稳定性最差。 本研究不仅奠定离子液体用于微生物细胞催化的理论基础,还提供一条高效制备对映体纯手性醇的新途径。……   
[关键词]:Acetobacter sp. CCTCC M209061细胞;4-三甲基硅基-3-丁炔-2-酮;(R)-4-三甲基硅基-3-丁炔-2-醇;离子液体;不对称还原反应
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华南理工大学2010年