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拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究

郭新军

  拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)是一种重要的经济昆虫,在分类学上隶属于节肢动物门、昆虫纲、膜翅目、胡蜂总科、蚁科、多刺蚁属。其个体发育过程中经历胚胎期、幼虫期、蛹期、成虫期等各个阶段,且是一种社会性昆虫,群体内存在严格的品级分化。拟黑多刺蚁资源较易获得,实验室养殖较为方便,因此是一种独特的进行个体发育及分化研究的实验材料。 本研究以拟黑多刺蚁为实验材料,通过RT-PCR、分子克隆、生物信息学分析、荧光实时定量RT-PCR等技术首次对与其肌肉发育及肌肉生理机能相关的肌细胞增强因子2(Mef2)基因和肌钙蛋白Ⅰ亚基(TnⅠ)基因分别进行了相关研究。主要获得了以下研究结果: 1通过实验获得了拟黑多刺蚁Mef2基因两种剪接体cDNA序列,其长度分别为2074bp和1793bp,主要在5 末端存在一定差异。通过ORF搜索发现,其编码区长度为1419bp,编码472氨基酸残基蛋白,且两种剪接体具有相同的ORF。将两种剪接体cDNA序列上传至美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank数据库,获得登陆号分别为GQ386849和GQ386850。 2对预测的PvMEF2蛋白进行同源性和系统进化分析,发现其N末端具高度保守的MADS和MEF2结构域,保守区域与其它昆虫相关序列一致性可达100%。构建的系统进化树中,膜翅目昆虫拟黑多刺蚁与意大利蜜蜂(Apis mellifera)和金小蜂(Nasonia vitripennis)聚为一支,进一步反映了各类群之间的进化关系。 3 PvMEF2蛋白的理论等电点和分子量分别是6.83和50191.5Da,其分子式为C2168H3392N6528O714S16,原子总数为6918。对其翻译后修饰分析发现,共有40个可能O型糖基化修饰位点和2个可能N型糖基化修饰位点;磷酸化修饰位点分别包括丝氨酸的磷酸化位点30个,苏氨酸6个,酪氨酸6个;目前为止还未发现其信号肽序列;该蛋白无跨膜区,为非跨膜蛋白。 4蛋白结构预测结果表明,PvMEF2 N末端存在螺旋、折叠和无规则卷曲等多种形式,这可能与MEF2通过N末端的结构形式与其它蛋白结合而发挥一定生理功能有关。 5相对实时定量分析结果表明,在不同的发育阶段虫体及成虫不同品级中,PvMef2基因均有表达,说明其在拟黑多刺蚁发育过程中持续具有调控作用。但其表达量有一定差异。在幼虫期,一龄幼虫中表达量最高,接下来的儿期幼虫呈下降趋势,而至蛹期时,其表达量又略有上升。成虫中Mef2在雄蚁中的表达量要高于其它两个品级的。不同的表达量可能影响到对不同肌肉发生相关基因的调控,从而影响肌肉发生。两种剪接体均有表达,但其表达量有一定的差别,不同剪接体在肌肉发生中的具体调控作用有待于进一步研究。 6获得两条长度分别为1224bp和799bp的拟黑多刺蚁TnⅠ基因不同剪接体cDNA序列。两条序列在3 末端存在一定差异,其开放阅读框分别为660bp和615bp,分别编码219氨基酸和204氨基酸蛋白。将序列分别上传至美国国立生物技术信息中心(NCBI) GenBank数据库,获得登陆号分别为HM484304和HQ230044。 7获得的TNI蛋白序列均与意大利蜜蜂(Apis mellifera)等昆虫同源序列具有较高的一致性。系统进化树中膜翅目昆虫拟黑多刺蚁与意大利蜜蜂聚在一起,再与其它昆虫聚为一类,各分支反映了不同类群之间的亲缘关系与进化关系,但不能明确说明各蛋白亚型之间的关系。 8 TNI两种蛋白亚型理化性质接近,并与意大利蜜蜂的相似。其翻译后修饰可能位点较少,仅分别具有1个O型糖基化修饰及11个磷酸化位点。分析发现该蛋白无跨膜区,为非跨膜蛋白。 9 TNI两种蛋白亚型二级结构主要包括了螺旋和无规则卷曲等区域,而没有明显的折叠区。其三级结构具明显的3个螺旋区。 10实时定量分析表明,TnⅠ 基因在拟黑多刺蚁各个发育阶段均有表达,但不同阶段的表达量有一定差别,可能与各个时期的肌肉结构及生理机能特点有关。不同亚型TNI在各个阶段的存在情况及功能仍需进一步的研究。 相关基因研究表明,在拟黑多刺蚁不同发育阶段及不同品级中,其肌肉分化与肌肉功能的调控与Mef2基因及TnⅠ基因存在一定关系,为研究昆虫肌肉发生及肌肉机能提供了理论基础。但其具体调控机制及基因的确切功能有待于进一步研究。……   
[关键词]:拟黑多刺蚁;肌肉增强因子2(MEF2);肌钙蛋白Ⅰ(TNI);分子克隆;实时定量RT-PCR
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:陕西师范大学2010年