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犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆与表达

陶玉成

  犬传染性肝炎(ICH)是由犬传染性肝炎病毒引起的一种常见的急性败血性传染病。本病主要发生于犬和狐,是当前养犬业和养狐业危害最大的动物疫病之一。本病临床上以马鞍型高热,严重血凝不良,肝脏受损,角膜混浊等为主要特征,多发生于1岁以内的幼犬,死亡率高达40%,给养犬业造成较大的经济损失。本研究工作主要包括以下三部分: 1.犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因的克隆及序列分析利用GenBank中发表的犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因序列,设计特异性引物,以从患病犬的血液中提取病毒基因组为模板,通过PCR克隆Hexon蛋白基因,构建亚克隆载体,通过实验室鉴定后再送测序检验。结果显示克隆的Hexon蛋白基因序列全长2718bp,编码由905个氨基酸组成的126KDa的蛋白质。克隆的Hexon蛋白基因存在六处突变,通过用核苷酸序列推导的蛋白序列进行比对发现第9bp、第2664bp和第2712bp处的突变为无意义的突变,其编码的氨基酸并未发生突变;第686bp处的碱基突变使缬氨酸变为了丙氨酸,第1678bp处的碱基突变使异亮氨酸突变为了亮氨酸,第2236bp处的碱基突变使苯丙氨酸突变为了亮氨酸。 2.犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白原核表达及免疫活性的检测用克隆的Hexon蛋白基因构建重组原核表达载体pGEX-6p-1-Hexon,以CaCl2法转化至大肠杆菌,获得多拷贝重组菌株,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE和Western-Blot分析结果表明,诱导表达的pGEX-6p-1-Hexon阳性菌株表达出大小为126kDa,具有反应活性的重组蛋白。 3.犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因原核表达条件的优化及蛋白纯化为了提高犬传染性肝炎病毒Hexon基因蛋白在大肠杆菌中的表达量,研究了温度、诱导时间以及诱导剂(IPTG)浓度等不同条件对Hexon蛋白表达量的影响。试验结果表明大肠杆菌菌株BL21(DE3)在37℃培养2.25h后,使用终浓度为2mmol/L的IPTG在27℃振荡诱导培养8h时,Hexon重组蛋白表达量最高。 本研究成功的克隆和表达了犬传染性肝炎病毒Hexon蛋白基因,通过表达条件的优化从而得到高效表达,为进一步研究六邻体蛋白的作用机理及亚单位疫苗的研究提供了实验基础。……   
[关键词]:犬传染性肝炎;Hexon蛋白基因;原核表达;表达条件优化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:新疆农业大学2010年