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猪囊尾蚴pVAX1-AgB重组质粒的免疫效果研究

巩伟

   猪囊尾蚴病是由猪带绦虫(Taenia Solium)幼虫寄生于人或猪等中间宿主引起的人畜共患寄生虫病。虽然传统的驱虫药物在囊虫病的治疗方面仍发挥着重要的作用,但是长期、多次用药因药物残留所致的食品安全问题直接影响着人体健康。这使得我们不得不改变思路,采用经济、安全、高效的疫苗防治该病的流行。猪囊尾蚴B抗原又叫副肌球蛋白,是由囊尾蚴体壁细胞产生并分泌到虫体外的一种蛋白质,该抗原可通过抑制补体激活途径,在囊尾蚴与宿主的免疫作用中对虫体起保护性作用,是WHO提出的血吸虫疫苗候选抗原之一,是一种最有希望的蠕虫疫苗候选抗原。 本研究根据GenBank中登录的AgB基因序列设计引物,利用RT-PCR技术从猪囊尾蚴总RNA扩增出AgB基因,连接到pGEM-T Easy载体并进行序列测定。结果表明,获得的AgB基因完整的开放阅读框(ORF)大小为2590bp,与GenBank中登陆的基因同源性达99.7%。同时,设计原核表达引物,以重组质粒pGEM-AgB为模板进行PCR扩增,经EcoR I、Not I双酶切,回收目的片段并与pGEX-4T-1载体连接,构建原核表达载体pGEX-AgB,在大肠杆菌中进行表达及纯化,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,结果在121ku处出现了清晰的目的蛋白条带,与预期的分子量大小相一致,经Western blot检测发现,表达产物能被猪囊尾蚴阳性血清所识别,说明表达的外源蛋白具有良好的免疫反应性。 设计哺乳动物表达载体引物,以重组质粒pGEM-AgB为模板,经PCR扩增,BamHⅠ、HindⅢ双酶切后连接哺乳动物表达载体pVAX1,构建重组质粒pVAX1-AgB。大量提取重组质粒,以100μg/只的剂量肌肉注射免疫5周龄健康BALB/c小鼠,同时设PBS和pVAX1质粒对照组,在免疫后不同时间采血进行ELISA抗体检测。结果显示小鼠免疫后2w即可检测到抗体,免疫后6 w达到高峰,且维持在一个较高水平,之后逐渐下降,38w后基本消失,抗体持续时间达8个月之久,而PBS组和pVAX1对照组则没有检测到抗体。 为了进一步研究pVAX1-AgB重组质粒的免疫效果,本实验以pVAX1-AgB重组质粒1000μg/头的剂量经肌肉免疫健康家猪,同时以AgB原核表达重组蛋白组(200μg/头)、pVAX1组(1000μg/头)和PBS组作为不同的对照组对该核酸疫苗进行全面评价,用ELISA测定各组的抗体水平,同时检测血清中IL-4和IFN-γ的表达水平。结果显示,pVAX1-AgB重组质粒组免疫后第4w即检测到抗体,第8w达到峰值;AgB重组蛋白组免疫后的2w即可检测到抗体,第6w达到峰值;pVAX1-AgB质粒组抗体水平明显低于AgB重组蛋白组。实验猪一免后pVAX1-AgB质粒组和AgB重组蛋白组IL-4、IFN-γ表达水平均升高,二免后又高于一免,两次免疫后IL-4、IFN-γ水平明显都高于免疫前(P<0.01);pVAX1-AgB质粒组和AgB重组蛋白组的IL-4、IFN-γ表达水平无明显差异,说明pVAX1-AgB重组质粒和AgB重组蛋白均有效诱导猪产生免疫应答,其中重组质粒组产生抗体的时间晚于重组蛋白组。pVAX1-AgB核酸疫苗与AgB重组蛋白疫苗实际免疫效果还有待于通过猪带绦虫虫卵攻击试验进一步验证,但本研究为研制基于AgB的安全、高效的猪囊尾蚴疫苗奠定了基础。……   
[关键词]:猪囊尾蚴;B抗原;DNA疫苗;BALB/c小鼠;家猪
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:新疆农业大学2010年