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犬细小病毒VP2基因的克隆、表达及其重组蛋白的抗原性研究

陈胜男

  犬细小病毒感染是由犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)引起的一种高度接触性传染病。其传播速度快,发病率和死亡率高,对家犬、经济动物及野生动物危害很大。目前,该病尚无有效的治疗方法。对其防治主要以弱毒疫苗免疫预防为主,但弱毒疫苗在使用过程中存在不安全问题,因此,急需一种安全有效的新型疫苗来预防该疾病。由于CPV的主要抗原位点位于VP2蛋白上,因此,VP2基因及其编码蛋白已成为研究犬细小病毒的热点。本研究工作主要包括以下四部分: 1.犬细小病毒巢式PCR检测方法的建立及应用 从临床上疑似感染CPV的犬粪便中提取总DNA。根据GenBank已发表的CPV特异保守的VP2基因序列设计二对引物,扩增出目的条带,进行测序。结果表明与国际标准的CPV VP2基因序列的同源性为99.3-100%。通过摸索重复性、特异性、敏感性试验,建立了巢式PCR方法。此方法具有良好的特异性和敏感性,适合于犬细小病毒的检测和分子流行病学调查。 2.犬细小病毒VP2基因的克隆及序列分析 根据GenBank中已发表的犬细小病毒基因序列,设计一对特异性引物,以巢式PCR检测的阳性样品DNA为模板,经PCR扩增,获得目的基因,将目的基因进行测序,结果显示,序列全长为1755bp,其核苷酸与国外和中国各地区流行株的同源性较高,介于98.4~99.8%之间,表明本研究成功克隆了CPV VP2基因。 3.犬细小病毒VP2基因的原核表达及免疫反应性研究 成功构建重组原核表达质粒pGEX-4T-VP2,用克隆的CPV VP2基因转化到E.coli BL21中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-Blotting分析,结果表明,诱导表达的pGEX-4T-VP2阳性菌株可表达出大小为90kDa蛋白,该重组蛋白具有反应活性。 4.犬细小病毒VP2基因的原核表达条件优化和蛋白纯化及免疫原性研究 为了确定VP2基因蛋白在大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)中表达的最佳条件,对诱导温度、诱导时间及IPTG浓度等条件进行优化。用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化出目的蛋白。 纯化的目的蛋白四次免疫小白鼠,ELISA结果显示GST-VP2融合蛋白抗血清效价随着免疫次数的增加而升高,表明得到的重组蛋白具有很好的免疫原性。可作为犬细小病毒的基因工程亚单位疫苗候选者。……   
[关键词]:犬细小病毒;VP2基因;原核表达;免疫活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:新疆农业大学2010年