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真菌松茸提取物在HBV转基因小鼠癌变中化学预防作用的初步评价

曹峻

  目的:在建立稳定的HBV转基因小鼠模型的基础上,应用真菌植物松茸提取物、α-干扰素化学性预防治疗HBV转基因小鼠,初步评价真菌植物松茸提取物与α-干扰素预防HBV转基因小鼠肝脏癌变作用的效果,研究真菌植物松茸提取物等药物可能的对HBV转基因小鼠组织、生化、免疫等方面的影响,进一步说明上述药物抑制HBV转基因小鼠肝脏癌变的作用机制。方法:按照标准随机选择56只HBV转基因小鼠C57BL/6J-TgN,随机分为真菌松茸提取物(AMH)组、α-干扰素(INF-α)组、α-干扰素联合AMH组、阴性对照组。每组14只,根据不同的给药方式预防性治疗12个月,其中,第11月经眼球内眦静脉取血1次,测血清AST。第12月末,每只小鼠称取体重,经摘眼球取血处死动物,待测血清标本。采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-10(IL-10);切除小鼠肝脏,称取肝脏的重量,观察肝脏的形态及有无异常结节性改变,并观察肺、脾、肾和淋巴结有无肿瘤及转移灶,一部分肝脏组织保存于10%福尔马林溶液中,另一部分肝脏组织立即放入冻存管中保存于液态氮中存储。制作标本蜡块和病理切片,光镜下观察不同组肝组织结构变化,包括非癌变组织和癌变组织的变化。确定每组小鼠中发生肝组织癌变的具体数量,计算不同组中转基因小鼠肝组织癌变的百分数。肝组织做成切片进行免疫组化检查,显微镜下观察乙肝表面抗原(HBsAg)、转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子β1受体Ⅱ(TβRⅡ)、磷酸化Smad2/3 (P-Smad2/3)、Smad4、Smad7在肝脏组织中的表达。以出现棕黄色为阳性,进行结果分析。选取液态氮中存储的肝脏组织,行实时荧光定量PCR检测(Real-time fluorescent quantitative PCR, RT-PCR)结果:1)肝脏组织形态改变:大体形态肝脏增大、肿胀,肝脏肿瘤结节为灰白色的单个或多个结节。光镜下可见:肝细胞弥漫性肿胀,细胞胞质伊红均染(毛玻璃样变),核内可见嗜酸性小体,肝细胞坏死,伴淋巴细胞浸润,散在单个肝细胞质固缩深染伴核固缩深染。肿瘤内可见明显异常核分裂像,癌细胞向肝组织周围浸润。AMH组预防性用药后,上述表现程度上稍轻,癌变发生的百分数稍低,但不能完全防止全部转基因小鼠肝脏炎性改变及癌变的发生;2)血清学指标:经治疗干预后,AMH组(294±51)、α-干扰素组(231±59)和α-干扰素联合AMH组(215±64)的AST值均低于阴性对照组(322±45)(P<0.05)。α-干扰素组、α-干扰素联合AMH组AST值分别低于AMH组(P<0.05)。而α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组比较,AST值差别无统计学意义(P>0.05);α-干扰素加AMH组(58.43±14.42)、AMH组(25.37±8.36)、α-干扰素组(35.84±12.36)与阴性对照组(15.75±8.45)相比,血清IL-2有增高(P<0.05);α-干扰素加AMH组与AMH组和α-干扰素组相比IL-2升高(P<0.05);a-干扰素加AMH组(12.03±6.54)与阴性对照组(45.97±14.03)、AMH组(21.58±11.20)、α-干扰素组(18.74±9.36)相比,血清TNF-α有明显降低(P<0.01);α-干扰素加AMH组(160.25±70.03)、AMH组(289.58±110.20)、α-干扰素组(240.69±95.36)与阴性对照组相比(375.03±120.48),血清IL-10值降低(P<0.05);α-干扰素加AMH组与AMH组、α-干扰素组相比,血清IL-10值也有降低(P<0.05);α-干扰素加AMH组中血清AST的水平与血清TNF-α水平呈负相关(F值6.529,P<0.05);3)免疫组化与RT-PCR指标:经治疗干预后,AMH组(4.92±1.20)、α-干扰素组(4.57±1.09)和α-干扰素联合AMH组(2.86±0.94)肝组织中的TGF-β1的表达均低于阴性对照组(6.53±1.78)(P<0.05)。联合AMH组分别与AMH组、α-干扰素组比较,肝组织中TGF-β表达的变化均有统计学意义(P<0.05);经治疗后,AMH组(3.51±1.78)、α-干扰素组(4.63±1.44)和α-干扰素联合AMH组(5.72±1.55)肝组织中Smad4的表达均高于阴性对照组(3.06±0.87)(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad4的表达高于AMH组有统计学意义(P<0.05);经治疗干预后,AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中P-Smad2/3的表达均高于阴性对照组(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad4的表达分别高于AMH组、α-干扰素组有统计学意义(P<0.05);经治疗干预后,AMH组(4.10±0.75)、α-干扰素组(4.57±0.93)和α-干扰素联合AMH组(5.38±1.25)肝组织中TβRⅡ的表达均明显高于阴性对照组(3.36±0.62)(P<0.01);经治疗后,AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中P-Smad2/3的表达均低于阴性对照组(P<0.05)。阴性对照组(5.38±2.21)、AMH组(5.19±1.91)、α-干扰素组(4.86±1.82)肝组织中Smad7的表达均高于α-干扰素联合AMH组(2.17±1.64)(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中TGF-β1mRNA的表达低于阴性对照组(P<0.05)。α-干扰素联合AMH组肝组织中TβRⅡmRNA的表达高于阴性对照组(P<0.05)。AMH组、α-干扰素组和α-干扰素联合AMH组肝组织中Smad2mRNA的表达均高于阴性对照组(P<0.05)。结论:1)HBV转基因C57BL/6J-TgN小鼠可以从HBV慢性感染状态发展到肝癌形成的过程,可以部分模拟人类的该病转归;2)应用HBV转基因C57BL/6J-TgN小鼠观察不同药物化学预防性治疗后,AMH可以明显改善肝脏功能,降低血清转氨酶水平,减缓癌变的发生;3)AMH可以诱导HBV转基因小鼠Thl类细胞因子作用增强,Th2类细胞因子作用降低,抑制恶性肿瘤的生成;4)AMH可能通过影响TGF-β/Smad信号通路的传导,降低肝癌的发生;5)AMH和α-干扰素的联用在预防肝癌发生中效果可能更强。……   
[关键词]:乙肝;转基因小鼠;松茸提取物;化学预防;癌变;动物模型
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:新疆医科大学2010年