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拟南芥隐花素CRY1在亚细胞结构的功能分析及激活标签突变体库的构建

曾建新

  植物生长发育过程受到多种外界环境因素影响,光作为主要的环境因子,不仅提供光合作用所需能量,而且在植物光形态建成等多个过程中起重要调节作用。高等植物进化具备了一套极其精细的光感受和信号转换系统,以监视光信号的方向、量和质,并调节植物的生长发育。大量研究表明,蓝光受体隐花素CRY1在介导蓝光调控植物生长发育过程中发挥了重要作用,包括抑制下胚轴伸长、刺激子叶展开、气孔开启、花青素的积累以及调节相关基因的表达等。随着研究的深入,进一步研究隐花素CRY1在亚细胞结构中的生物学功能以及分离、鉴定与隐花素信号传导相关的组分对阐明其作用机制十分重要。本论文通过不同的光处理,探讨隐花素CRY1在植物亚细胞中的定位及受光诱导转移的过程。在此基础上,以隐花素cry1-304突变体为研究背景构建CRY1-GR/cry1-304转基因植株,采用外源糖皮质激素控制隐花素CRY1在细胞核--细胞质间的分布,以期阐明隐花素CRY1在亚细胞结构中的生物学功能。最后,以隐花素cry1cry2突变体为研究背景构建了激活标签突变体库,分离、鉴定与隐花素下游信号转导相关的组分。通过遗传、分析等方法,主要取得以下结果: 1.将35S::CRY1-GFP转基因植株在黑暗中培养5天后,采用不同的光处理,实时观察CRY1-GFP融合蛋白在亚细胞中的定位及受光诱导转移过程。实验发现:黑暗条件下CRY1-GFP融合蛋白定位在细胞质中且荧光强度非常微弱;随着蓝光处理时间的延长和光强的增大,GFP荧光逐渐增强,在亚细胞结构(细胞膜、细胞质、细胞核)中均有表达,实验表明CRY1蛋白表达受蓝光诱导,且与光照时间和强度成正比。在蓝光处理过程中(0-15 min),CRY1-GFP融合蛋白从细胞质、细胞膜向细胞核内转移聚集;蓝光处理15 min时,细胞核中GFP荧光强度达到最高,且细胞核与细胞GFP平均荧光强度的比值达到峰值。蛋白免疫杂交结果进一步证实,在蓝光下(0-15 min)GFP蛋白表达与蓝光处理时间成正比。实验首次发现:CRY1-GFP融合蛋白在蓝光诱导下,由细胞质、细胞膜向细胞核内转移累积,这种转移与红光无关。 2.将黑暗中培养5天的野生型黄化苗采用不同的光照处理30 min,提取细胞核蛋白。蛋白免疫杂交检测隐花素CRY1蛋白表达量显示:蓝光下,细胞核内CRY1蛋白表达量比黑暗、红光高,黑暗条件下CRY1蛋白表达量最低。结果进一步证实细胞核内隐花素CRY1蛋白特异性受蓝光诱导表达,或CRY1蛋白受蓝光诱导完成由细胞质、细胞膜向细胞核的转移过程。 3.以隐花素cry1-304突变体为研究背景,成功构建了CRY1-GR/cry1-304转基因植株。实验发现:CRY1-GR/cry1-304转基因植株仅在蓝光和外源糖皮质激素同时存在的条件下回复野生型表型,包括抑制下胚轴的伸长、子叶的展开、花青素的累积及气孔的开启等。实验证实:核定位信号(NLS)和光子激活两要素是隐花素CRY1在细胞核中发挥生理功能的充分必要条件。实验首次将糖皮质受体GR作用机理运用到隐花素CRY1基因功能研究,并证实细胞核隐花素CRY1与下胚轴的伸长、气孔的开启相关;细胞质隐花素CRY1与子叶的展开、叶柄的伸长和花青素的积累相关。 4.以隐花素cry1cry2突变体为研究背景,构建了基因功能获得型T-DNA突变体库,获得了近2 000个独立转化株系。从T1代转基因植株中筛选获得35个株系,与cry1cry2突变体表型明显不同。从中筛选得到一组有价值的光周期开花突变体,为进一步研究隐花素与植物光形态建成提供了宝贵实验材料。采用IPCR法,成功获得了Scc101-D突变体基因组T-DNA插入位点旁邻序列。实验发现,Scc101-D突变体晚花的表型是与At5g28237基因超量表达相关。 5.以野生型为研究背景构建AT5G28237过量表达转基因植株,该转基因植株开花延迟,进一步证实Scc101-D突变体晚花表型是由AT5G28237基因超量表达所致。基因枪轰击洋葱表皮实验首次发现该基因定位在细胞质中,且无组织特异性表达。AT5G28237转基因植株发育缓慢,表明At5g28237基因过表达影响了色氨酸的合成。外源色氨酸能部分恢复至野生型表型,暗示At5g28237基因在拟南芥的生长发育过程中还行使了其他功能。此外,转基因植株的光周期途径开花关键基因FT和CO的转录水平显著降低,结果进一步证实其参与调控植物的开花信号途径。……   
[关键词]:拟南芥;隐花素;GFP;突变体;下胚轴;开花
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:湖南大学2010年
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