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Nup107和claudin23在转移性胰腺癌中的作用及分子机制的初步研究

王巍

   前言 胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤,一个重要原因是胰腺癌具有的高度侵袭转移特性。在前期研究中,利用仓鼠实验性胰腺癌模型建立了两种转移能力完全不同的细胞株,解离型高转移(PC-1.0)和非解离型低转移(PC-1)胰腺癌细胞。在前期研究中,我们通过cDNA微阵列分析(cDNA microarray analysis),发现核孔蛋白107(nucleoporin 107kDa, Nup107)及紧密连接蛋白claudin23是解离型高转移株PC-1.0细胞与非解离型低转移株PC-1细胞中的差异表达基因。 核孔复合体(Nuclear pore complexes, NPC)是近年来发现的贯穿于核膜作为细胞核与细胞质物质交换的惟一通道,在细胞正常的生长与分化中发挥着重要作用。研究已发现核孔蛋白结构与功能的改变与疾病及肿瘤发生、发展的关系密切。Nup107是核孔复合体中的一员,是NPC结构的重要核孔蛋白。有文献报道脑恶性胶质瘤细胞中Nup107表达显著增多,但Nup107在胰腺癌中作用尚无报道,其在肿瘤细胞中的作用机制也不清楚。claudin蛋白是构成细胞膜紧密连接至关重要的成分,claudin属于一个多基因家族,到目前为止,已有24种claudin成员被发现,其遗传表达的变化可导致上皮细胞、内皮细胞结构破坏、功能受损,与多种疾病的发生、发展存在密切关系,现已证实claudin家族蛋白成员在肿瘤发生、发展,肿瘤侵袭转移中具有重要作用。有文献报道claudin23在肠型胃癌中下调,但其在胰腺癌中作用尚无报道,其在肿瘤细胞中的作用机制不清楚。 前期研究表明促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的活化密切参与胰腺发生发展过程的调控,其具体分支通路定位于表皮生长因子受体(EGFR)/丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)。但胰腺癌中Nup107及claudin23的表达与MAPK信号转导通路的关系尚不明确。 本研究中利用免疫细胞化学和RNA干扰的等技术,探讨究Nup107及claudin23在胰腺癌细胞株中的作用及相关作用机制。初步探讨Nup107及claudin23在胰腺癌发生及进展中的作用。 目的 初步探讨Nup107及claudin23在胰腺癌进展中作用的分子机制。同时为开发新型抗胰腺癌侵袭转移的高效治疗方法提供具有重要参考价值的新靶标。 方法 1.用RT-PCR、Western-blot方法验证Nup107 mRNA在解离型高转移株PC-1.0细胞与非解离型低转移株PC-1细胞中表达存在差异。 2.用脂质体转染法将Nup107 siRNA转染入解离型高转移株PC-1.0胰腺癌细胞。用RT-PCR和Western-blot观察转染48h后PC-1.0胰腺癌细胞中Nup107mRNA、蛋白的表达以及MEK mRNA、蛋白的表达变化;应用流式细胞技术及CCK-8法分别检测转染后PC-1.0胰腺癌细胞细胞周期及增殖的变化情况;Papanicolaou S染色法观察细胞解离状态及Transwell小室结合Matrix胶检测侵袭能力的变化。 3.用稳定转染MEK1-shRNA和MEK2-shRNA的PC-1.0细胞检测Nup107 mRNA及蛋白表达的变化。 4.用RT-PCR、Western-blot及免疫细胞化学方法研claudin23的表达及定位变化与胰腺癌细胞解离的关系。 结果 解离型高转移株PC-1.0细胞中Nup107 mRNA及蛋白表达高于非解离型低转移株PC-1细胞中表达;转染Nup107 siRNA 48h组与各对照组细胞相比,Nup107的mRNA、蛋白的表达明显减少(P<0.01),PC-1.0细胞在转染48h后细胞Gl期比例增加,S期、G2期细胞减少,细胞增殖受到抑制;细胞解离受到抑制,侵袭能力降低。稳定转染MEK1-shRNA和MEK2-shRNA的PC-1.0细胞与PC-1.0细胞相比,在MEK1-shRNA细胞中nup107 mRNA及蛋白表达减少明显,而在MEK2-shRNA细胞中减少不明显。claudin23 mRNA及蛋白在解离型高转移株PC-1.0细胞中低表达,而非解离型低转移株PC-1细胞中高表达,MEK1-shRNA的PC-1.0细胞中claudin23 mRNA及蛋白表达增加,而在MEK2-shRNA细胞中变化不明显。而PC-1+DF处理后,claudin23表达明显减少(P<0.05)并破坏claudin23在细胞膜的定位,细胞开始解离。 结论 1.Nup107参与胰腺癌细胞解离状态、增殖、细胞周期及体外侵袭的调控。 2.Nup107参与胰腺癌的发展过程,其具体的机制可能为主要通过MEK1信号转导通路调控胰腺癌的增殖及细胞周期的变化,并通过MEK2信号通路调控胰腺癌的癌细胞解离状态及侵袭能力。 3. MEK1/2信号转导通路通过调控Nup107的表达,来影响胰腺癌细胞解离状态、增殖、细胞周期及侵袭能力。 4.claudin23表达及定位与胰腺癌细胞解离状态密切相关,其可能的分子机制为,激活了MEK2信号通路。……   
[关键词]:胰腺癌;Nup107;Claudin23;细胞解离;细胞侵袭
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国医科大学2010年