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垂体瘤转化基因RNA干扰对胶质瘤细胞增殖、凋亡及化疗敏感性影响的实验研究

戴如飞

  目的:明确垂体瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene ,PTTG)的表达与胶质瘤临床病理级别和患者预后的相关性。构建PTTG RNA干扰载体,观察PTTG RNA干扰对细胞增殖、凋亡及对化疗敏感性的影响。 方法:选择80例胶质瘤手术标本,按WHO胶质瘤分级标准,包括Ⅰ级16例、Ⅱ级22例,Ⅲ级26例、Ⅳ级16例,患者生存时间<12月22例,12-36月41例,>36月17例,复发时间<12月18例,12- 36月39例,>36月23例。免疫组化检测PTTG表达,测定其积分光密度值(IOD)。 根据PTTG基因cDNA序列,设计针对PTTG基因的3组干扰序列,并设计1组阴性对照序列,克隆到真核表达载体pGenesil-1中,进行酶切鉴定和测序鉴定。将构建好的4组重组质粒分别命名为PTTG-1组,PTTG-2组,PTTG-3组、阴性对照NC(negative control)组。利用RNA干扰技术,将以上shRNA分别转染细胞中,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PTTGmRNA表达水平、Western Blot检测PTTG蛋白表达水平。 选取干扰效果最强的shRNA片段转染U251细胞,另用替莫唑胺(temozolomide,TMZ)作用于转染shRNA片段的U251细胞,四甲基偶氮唑盐( methyl thazoy terazolium, MTT)比色法检测细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果:免疫组化结果显示80例胶质瘤标本中,其IOD值Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级分别为0.69±0.06、0.76±0.08、1.32±0.12、1.67±0.15,随着肿瘤级别的增高而升高,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。患者复发时间越长,PTTG蛋白表达越低,复发时间越短,PTTG蛋白表达越高,其IOD在复发时间<12月组、12-36月组、>36月组分别为1.60±0.20、0.98±0.10、0.61±0.08,各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。PTTG蛋白表达与生存时间的关系显示患者生存时间越长,PTTG蛋白表达越低,生存时间越短,PTTG蛋白表达越高,其IOD在生存时间<12月组、12-36月组、>36月组分别为1.55±0.14、1.01±0.13、0.65±0.08,各组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。 构建的PTTG RNA干扰序列和阴性对照序列经酶切和基因测序证明插入序列正确,说明PTTG RNA干扰真核表达质粒和阴性对照表达质粒构建成功。 细胞在转染PTTG干扰载体后,提取细胞的总RNA,经RT-PCR电泳发现,在转染24h后,PTTG-2、PTTG-3即显示出抑制作用,PTTGmRNA表达水平降低,PTTG-1组对目的基因的抑制作用不明显;在转染48h后,各组均显示出抑制作用,但PTTG -3的抑制作用更明显;转染72h后,PTTG-1组有微弱的抑制作用,PTTG -2及PTTG -3组仍有显示明显的抑制作用,但PTTG -3抑制作用较PTTG -2更强烈。 Western blot检测不同时间PTTG蛋白的变化显示,在转染24h后,PTTG-1、PTTG-2、PTTG -3组对目的基因的抑制作用均不明显;在转染48h后,PTTG-1、PTTG-2、PTTG-3组均显示出抑制作用,但PTTG-3的抑制作用更明显;转染72h小时后,PTTG-1组没有抑制作用,PTTG-2及PTTG -3组仍有显示明显的抑制作用,但PTTG -3抑制作用较PTTG-2更强烈。 PTTG-3及PTTG-3联合TMZ作用细胞48h后,MTT实验结果显示,细胞生长和存活能力受到明显的影响,细胞增殖活性结果显示OD值在对照组、TMZ组、PTTG -3转染组、PTTG-3联合TMZ组分别为0.85±0.07、0.58±0.06、0.55±0.07、0.41±0.05,TMZ组、PTTG -3转染组、PTTG-3联合TMZ组细胞增殖抑制率分别为(31.56±5.51)%、(35.53±4.60)%、(51.49±6.74)%,PTTG-3组及TMZ组与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),而PTTG-3联合TMZ组抑制细胞增殖更明显,与PTTG -3组及TMZ组比较差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测细胞凋亡显示48h对照组凋亡率为(6.29±0.78)%,TMZ组为(33.63±4.88)%,PTTG-3组为(39.61±4.95)%,PTTG -3联合TMZ组为(66.23±7.60)%,PTTG -3组及TMZ组与对照组比较差异差异有统计学意义(P<0.01),而PTTG -3联合TMZ组的凋亡率较PTTG-3组及TMZ组明显增高,组间比较与差异有统计学意义(P<0.01)。 结论:PTTG与胶质瘤病理级别和预后密切相关,可以作为肿瘤恶性程度和预后的指标, PTTG RNA干扰可以抑制胶质瘤细胞生长,诱导细胞凋亡,且可以增强胶质瘤细胞对化疗药物的敏感性,提高化疗效果。……   
[关键词]:神经胶质瘤;垂体瘤转化基因;RNA干扰;细胞增殖;细胞调亡;化疗敏感性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:苏州大学2010年