手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

海洋拮抗菌JG1的分离鉴定、应用及热激蛋白DnaK的保护机制初探

金光

   在海水鱼类养殖过程中,细菌性病害的频发是制约其发展的一个重要因素。有益菌和免疫刺激剂的应用为水产养殖的可持续发展提供了良好的解决办法。本研究的目的主要有,首先通过比较健康的和发病的大菱鲆养殖环境微生物区系,找出微生物区系和病害暴发之间的潜在关系,并从中筛选出具有有益菌潜力的菌株;其次,对于有优良潜力的菌株,进行有益菌应用方面的测试,如对致病菌是否有拮抗作用,是否对动物致病,是否能在肠道内定植等等,并对菌株进行分类鉴定。最后,建立基于PCR的快速检测方法,可用于跟踪检测有益菌的应用情况。另外,还以卤虫(Artemia franciscana)为对象,初步探讨了过量表达DnaK的大肠杆菌对于宿主在抵抗致病菌时的作用及其可能的作用机制,为免疫刺激剂的应用提供了理论基础。 本研究自2006年6月至2007年4月共采样6次,以其中一次鱼病暴发的样品为例对大菱鲆养殖环境的微生物区系进行了初步研究。本次采样中病鱼的症状主要是颌部破损,肝脏变色等症状。进一步测定池水的水质情况,并用平板涂布法计算了其池水和肠道内的总菌数、总活菌数、总异养菌数和总弧菌数。与健康组的比较的结果来看,两者水质因子都在正常范围内,但发病组水体和肠道的总异养菌数较低,而弧菌数则高出很多。应用PCR-RFLP对肠道微生物进行了聚类分析,其结论与平板涂布时一致,即健康组的菌种多样性比发病组的丰富。 有益菌在水产养殖中已有了良好的应用,因此,我们首先以哈维氏弧菌(Vibio harveyi) SF1为指示菌,对6次采样所分离的234株细菌进行了拮抗菌的筛选,得到了一株拮抗作用较强的菌株JG1。抑菌谱测定实验显示,JG1对多个种属的致病菌具有拮抗作用,包括弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)和发光杆菌属(Photobacterium),尤其是弧菌属。其中对鳗弧菌VIB72、杀鲑气单胞菌ASl和嗜水气单胞菌AHK1、AHU1抑菌效果最强。随后对JG1进行了分类鉴定,JG1为革兰氏阴性杆菌、端生鞭毛并产金黄色色素,结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,最终鉴定为金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonasflavipulchra)。JG1分离自健康大菱鲆的养殖水体,这是国内首次报道对某些病原菌有良好抑菌效果的金丽假交替单胞菌,并且有很好的有益菌应用潜力。接着以斑马鱼、扇贝、牡蛎和虾蛄为实验动物检验了JG1的致病性,结果显示JG1对上述动物无致病性。液体培养基对抗实验表明JG1能对坎贝氏弧菌(Vibrio campbellii) VC产生抑制作用。最后用卤虫无菌系统对JG1的体内定植能力进行了考察,从7天内卤虫体内JG1的密度来看,JG1在体内的定植能力较弱,可能更适合于直接添加到水体。另外,成功设计了P. flavipulchra的特异性引物JG153f和JG864r,建立了基于gyrB基因的PCR快速检测方法。 免疫刺激剂的使用是另一种广泛应用于水产养殖的病害防治方法。DnaK是热激蛋白(Hsp)的一种,具有鱼疫刺激剂的效果。本研究用卤虫无菌系统分别考察了无菌环境下、开放环境下以及大体积开放环境下,YS2(可诱导表达DnaK)对于卤虫对抗VC的作用,结果显示在三种环境下,YS2均可显著提高卤虫的成活率。我们还用PCR-DGGE的方法考察了抵抗实验期间,卤虫体内微生物区系的变化情况,DGGE图谱的比较分析显示,对抗期间卤虫体内的优势菌群没有明显变化,因此推测,DnaK的作用机制可能与卤虫体内微生物区系的变化之间无直接关系,而可能与宿主免疫系统的提高有关。……   
[关键词]:微生物区系;有益菌;金丽假交替单胞菌;免疫刺激剂;热激蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年