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中国对虾应答WSSV侵染相关基因的研究

赖晓芳

   由白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)引起的对虾白斑综合征病毒病是一种高度传染的病毒性疾病,自1993年爆发以来已经给对虾养殖业造成了巨大的经济损失,但时至今日仍然缺乏有效应对该病毒传播的方法。经过多年的养殖实践和病毒感染实验表明,中国对虾存在一定的抗该病毒感染遗传机制,但具体机制有待进一步阐释。因此,本研究希望从分子水平出发,探讨中国对虾应答WSSV侵染相关的一些基因,为防控WSSV引起的病害提供新的参考资料。本研究以抗病性较强的中国对虾“黄海2号”作为实验材料,对中国对虾应答WSSV侵染相关的基因进行了筛选,并对可能在应答中有重要作用的几丁质结合蛋白(FcCBP)、β-1,3-葡聚糖结合蛋白(FcβGBP-HDL)、转录抑制子(FcTR)、C-型凝集素(FcCTL)和谷氨酰胺合成酶(FcGS)等五个基因进行了克隆,分析了它们的分子结构特征,预测其可能的生物功能,并研究了其组织分布情况以及WSSV感染后不同组织、不同时间段的表达规律,取得了以下一些结果和结论: 1、通过mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)分析感染试验中早期濒死和20 d后存活对虾基因表达的差异,共回收46个阳性差异片段。差异片段序列同源性功能分析结果表明,差异片段所编码的蛋白主要参与氧化磷酸化、蛋白质合成、糖酵解、信号转导等生物过程。 2、从中国对虾中克隆了一个新的几丁质结合蛋白(FcCBP)基因,全长1250bp。其编码的蛋白质含190氨基酸,在C-末端具有一个2型几丁质结合域(ChtBD2),与丽蝇蛹集金小蜂几丁质结合蛋白的相似度最高,为34%。FcCBP的基因DNA由5个外显子和4个GT-AG型内含子组成。FcCBP在未感染WSSV中国对虾所有检测组织中均有转录,其中肠转录水平最高;感染WSSV后,肝胰腺中的表达在0-6 h迅速上升,然后下降;鳃的表达情况相似,在0-12 h上升至最高峰,然后下降。此结果表明,FcCBP在应答WSSV侵染时表现为应急诱导表达,可能在第一道防线上阻止WSSV的进一步侵染。 3、从中国对虾中克隆了β-1,3-葡聚糖结合蛋白(FcβGBP-HDL)基因,全长6713 bp。其编码的蛋白质预测分子量为240.7 kDa,是已知分子量最大的一种βGBP,含一个RGD和两个无催化活性的葡聚糖苷酶域,与凡纳滨对虾βGBP-HDL相似度最高,为88%。FcβGBP-HDL基因组DNA不含内含子,启动子1507 bp,含有2个GATA-1,3个AP-1和1个c-Ets-1等参与其它节肢动物免疫基因转录调节的结合位点。FcCBP在未感染WSSV中国对虾所有检测组织中均有转录,其中肌肉转录水平最高;感染WSSV后,FcβGBP-HDL肝胰腺的表达在0~6h急剧下降至最低值,然后迅速回升,96h达最高值;而鳃中的表达量变化是在0~6h急剧上升至最高峰,然后下降,96h到达最低值。推测FcβGBP-HDL在应答WSSV侵染中可能作为葡聚糖受体参与对虾免疫反应的调节,并作为一种可诱导的敏感表达基因,启动防御反应。 4、本研究首次从中国对虾中克隆了转录抑制子(FcTR)基因,全长1397bp。其编码的蛋白质含354个氨基酸,C-末端串联了4个识别并结合特异性启动子的ZnF_C2H2 domain及2个抑制转录活性的SFP1。FcTR与文昌鱼转录抑制子相似度最高,为68%。FcTR基因组DNA含4个外显子和3个内含子,启动子516bp。FcTR在未感染WSSV中国对虾所有检测组织中均有转录,其中肠转录水平最高;感染WSSV后,FcTR在肝胰腺中的表达在0~6h迅速下降至最低值,然后上升;鳃中的表达在0~6h迅速上升,24h到达最高值,然后下降。推测FcTR可能通过抑制一些与WSSV侵染有关的基因转录来防止WSSV侵染。5、本研究克隆了一个新型C-型凝集素(FcCTL)基因,全长859bp。其编码含220个氨基酸的蛋白质,C-末端具有糖识别域CRD。FcCTL基因组DNA由5个外显子和4个GT-AG型内含子组成,内含子3含有三个CT型微卫星DNA序列,内含子4有CA型和GT型两个微卫星DNA序列;启动子723bp,仅有的1个启动子序列位于内含子1。FcCTL在未感染WSSV中国对虾的肝胰腺、肌肉、肠和鳃中均有转录,其中肝胰腺转录水平最高。感染WSSV后,FcCTL在肝胰腺中的表达在0~24h上升,24h到达最高值,然后下降;鳃中的表达在0~6h迅速上升至最高值,然后下降。结果暗示FcCTL可能在应答WSSV侵染中表现出比其它凝集素更重要的免疫活性,可以在更大范围组织中抵御病原体的入侵。 6、本研究首次报道了谷氨酰胺合成酶(FcGS)基因,cDNA全长为1444bp,编码366个氨基酸。FcGS与眼斑龙虾谷氨酰胺合成酶的相似度为87%,N-末端有1个谷氨酰胺合成酶beta-Grasp域,C-末端有1个谷氨酰胺合成酶催化活性域。FcGS基因组DNA由2个外显子和1个GT-AG型内含子组成,内含子位于ORF外;启动子314 bp。FcGS在未感染WSSV中国对虾所有测试组织中均有转录,肌肉的转录水平最高。感染WSSV后,FcGS在肝胰腺的表达变化为~-48h到达最高值后下降;鳃的表达变化为在0~6h迅速上升至最高值,然后下降。结果表明,FcGS可能也参与了中国对虾应答WSSV侵染的过程。 本研究从中国对虾中克隆的五个基因具有与应答侵染有关的结构,受到WSSV侵染后的表达在相应的组织中发生相应的变化,它们很可能是中国对虾应答WSSV侵染相关众多基因中的一部分。本研究还发现五个基因在鳃中的表达变化惊人的一致,0-6 h均迅速上升至最高峰,然后下降;在肝胰腺中的表达整体上表现为上升的趋势。由此可见,鳃和肝胰腺是中国对虾应答WSSV侵染的主要组织,二者在应答过程中所起的作用不同,鳃作为对虾免疫应答的第一道防线,往往表现出急性诱导效应,而肝胰腺作为产生体液免疫活性分子的主要组织,在免疫应答中表现为延迟效应。有关这些基因在中国对虾应答WSSV侵染的机制还有待于进一步深入研究。……   
[关键词]:中国对虾;WSSV;OORT一PCR;免疫应答相关基因;克隆
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2010年